在生物催化领域，高效催化的酶对催化反应的进行是至关重要的。烯键还原酶（enoate reductases，ERs）作为一类受到广泛关注的新型酶，能够高选择性地还原碳碳双键，近年来对其高效催化酶源的研究成为热点。带有吸电子基团的饱和化合物是医药、激素、香料、以及农药生产等方面的重要物质，常常需要由其α，β-不饱和化合物选择性还原获得，但吸电子基团易使烯烃钝化，对其进行选择性还原是一个富有挑战性的课题。化学合成中最常用过渡金属及其络合物对该类化合物还原，此法存在成本高，条件苛刻，产率低、会污染环境等缺点。研究表明，生物界中的烯键还原酶能够还原碳碳双键，且选择性高，产率好，条件温和，是一条环境友好的合成途径。目前对于能够进行高效催化的烯键还原酶种类研究还很少，几乎没有可以用于工业生产应用的。本文对来自枯草杆菌的烯键还原酶基因进行表达纯化，并将其应用于一系列底物催化。烯键还原酶催化过程中需要昂贵的辅酶NAD(P)H的参与，为解决这一问题对辅酶再生体系进行了研究。同时，首创对烯键还原酶固定化方面的研究。一、烯键还原酶的克隆表达从枯草杆菌中获得的烯键还原酶基因BS1K成功在大肠杆菌BLP中表达。诱导条件为：IPTG终浓度为0.2mM，25℃，120rpm震荡12h。将可溶表达的目的蛋白镍柱纯化，最适的咪唑洗脱浓度为80mM。二、烯键还原酶催化反应将纯化的BS1K用于依赖于NADH的催化反应，底物类型范围包括：α,β-不饱和羰基、羧酸、酯、硝基与硝基醇化合物。BS1K对于不饱和羰基化合物的具有良好的区域选择还原催化效力。以4-甲氧基苯丁烯酮为模型确定最佳催化条件：7.5mg/mL酶浓度，11mg/mL NADH添加量，Na2HPO4-柠檬醛作为缓冲液，10mM底物浓度。在此条件下，转化率达到＞99%。该重组酶对于α,β-不饱和硝基和硝基醇也具有还原能力。其中，1-溴-4-(2-硝基乙烯)苯在PBS缓冲液中的转化率比Tris-HCl中的要高，达到37%。该酶对带有一个吸电子基团的不饱和酸和酯开链化合物不具备催化能力。烯键还原酶成功对α，β-不饱和硝基和硝基醇类的前手性化合物进行催化，生成的产物中，手性碳位于α处时生成的是消旋体，位于β处的产物具有较好的对映体选择性（81%）。三、辅酶再生研究本文采用以NAD+/GDH的辅酶再生体系催化反应，经过结果比较，辅酶再生体系的转化速率大于NADH参与的催化，后者大于菌体催化的反应。另外，辅酶再生体系还能催化NADH单独作为辅酶时不能催化的（1-硝基-1-烯-2-甲基）苯。四、烯键还原酶固定化利用无载体的固定化技术-交联酶聚集体（CLEAs）技术对烯键还原酶进行固定化实验。实验分为两部分：单酶固定化和双酶固定化。单酶固定化是对重组烯键还原酶BS1K的固定化实验。经过沉淀和交联两个步骤条件的优化，最终得到活力回收为39%的固定化酶。优化的固定化条件为：3.5M的硫酸铵作为沉淀剂沉淀45min，4%（v/v)戊二醛作为交联剂交联3h。将固定化酶进行7次重复利用实验后，酶活残留81.4%。双酶固定化是对BS1K和GDH的共固定化。固定化条件条件：7M的硫酸铵作为沉淀剂沉淀2h，3%（v/v)戊二醛作为交联剂交联3h，得到活力回收率BS1K为45.7%，GDH为4.25%。7次重复使用后，酶活残留76%。本实验成功表达烯键还原酶BS1K，该酶在对一系列底物的催化中展示出了优良的催化效力，首次对其进行固定化实验，为以后的手性化合物合成和工业大规模应用提供新的研究思路。