本研究主要探讨精子载体法介导生产牛转基因胚胎的相关影响因素,以便为建立精子载体法介导生产转基因牛的技术平台奠定基础。首先探讨了不同个体精液的洗涤次数、精子与IFN-EGFP质粒孵育的时间和浓度、线性/环状质粒比例等相关因素对IVF介导的牛转基因效果的影响。试验选择广娟3、6、10号三头牛的精液,分别洗涤1-4次后检测精子活力和精子携带外源质粒的阳性率,结果发现,广娟3号、6号牛精子活力随洗涤次数的增加呈显著性下降(P<0.05),而广娟10号牛精子洗涤两次后的精子活力与洗涤一次和三次的精子活力相比差异不显著(0.69vs0.77、0.65,P>0.05),且洗涤三次时精子活力显著高于广娟3号和广娟6号(0.65vs0.57、0.56,P<0.05)；精子孵育质粒后其阳性率随着洗涤次数增加而增加,广娟10号牛精液洗涤二次或三次的精子阳性率均显著高于广娟6号和广娟3号(P<0.05)。当广娟10号牛精子与质粒分别孵育不同时间(10min、30min、60min、90min和120min)时,孵育时间为l0min、30min组的精子活力与对照组无显著差异(P>0.05),且显著高于60min、90min、120min组(P<0.05),但30min组的精子阳性率显著高于1Omin组(20.98%vs10.62%),而与60min、90min、120min各组间差异不显著(P>0.05)；精子与质粒孵育不同时间后进行IVF,发现30min组的分裂率和囊胚率均显著高于60min组(63.84%vs50.52%；23.52%vs15.77%,P<0.05),而30min组和60min组间的分裂阳性率和囊胚阳性率差异不显著(P>0.05)。当孵育时间一定、精子与不同的质粒浓度孵育时,75nG/μl组的精子阳性率显著高于其他试验组(P<0.05),IVF后试验组的分裂率和囊胚率间差异不显著(P>0.05),但50ng/μl组的分裂阳性率和囊胚阳性率分别显著高于25ng/μl、100ng/μl组(38.66%vs26.94%、23.60%；19.05%vs7.14%、5.56%,P<0.05),而与75ng/μl组差异不显著(P>0.05)。将线性/环状比例分别为0：1、1：0、1：1的质粒与精子进行孵育,各比例组的精子阳性率无显著性差异(30.47%vs28.86%vs30.21%；P>0.05),进行IVF后,各组间的分裂率、分裂阳性率、囊胚率、囊胚阳性率无显著性差异(P>0.05)。其次比较了精子处理方式、精子与IFN-EGFP质粒孵育的浓度对ICSI介导的牛转基因效果的影响。结果显示,采用简单共孵育、NaOH.冻融三种方式处理精子,精子阳性率分别为31.09%、37.19%、48.47%,各组间精子阳性率差异显著(P<0.05)；分别采用这三种方式处理后的精子进行ICSI操作,冻融组的囊胚率显著低于简单孵育组(36.15%vs44.93%,P<0.05),但显著高于NaOH组(36.15%vs32.11%,P<0.05),且冻融组的囊胚阳性率显著高于简单孵育组(28.29%vs10.28%,P<0.05),而分裂率和分裂阳性率各组间差异不显著(P>0.05)。当冻融精子分别与5、25、50、75、l00ng/μl不同质粒浓度孵育时,发现75ng/μl组与100ng/μl组的精子阳性率显著高于5ng/μl组、25ng/μl组和50ng/μl组(51.07%、51.19%vs17.87%、31.51%、46.14,P<0.05)。将经不同浓度质粒孵育后的冻融精子进行ICSI操作,除75ng/μl组的分裂率显著低于各试验组外(P<0.05),其他各试验组间差异不显著(P>0.05)；除5ng/μl组的分裂阳性率显著低于各试验组外(P<0.05),其他各试验组间差异不显著(P>0.05)；50ng/μl组的囊胚率显著高于75ng/μl组,且其囊胚阳性率显著高于其他各试验组(P<0.05)。以上结果表明：(1)公牛个体差异以及精子洗涤次数对牛的精子活力、精子结合外源IFN-EGFP质粒的效率有影响；(2)精子与外源IFN-EGFP质粒孵育的浓度和时间对牛精子活力、精子结合外源质粒的效率和IVF介导的牛转基因效果均产生一定的影响,以质粒孵育浓度为50ng/μl、孵育时间30min为宜；(3)线性/环状IFN-EGFP质粒的不同比例对IVF介导的牛转基因效果无影响；(4)精子处理方式以及精子孵育的IFN-EGFP质粒浓度对ICSI介导的牛转基因效果有影响,经冻融方式处理的精子与浓度为50ng/μl的质粒浓度孵育可提高ICSI介导的牛转基因效率。