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金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3～5d才能完成,且灵敏度较低。本研究针对食品中金黄色葡萄球菌PCR检测的特殊性,建立了快速检测乳品中金黄色葡萄球菌的PCR方法,消除PCR反应抑制因子,缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间,提高检测方法的灵敏性,为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。 本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测乳品中的金黄色匍萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序,其适宜反应体系为:5μl 10XPCR buffer（200mM Tris-HCl[pH 8.3], 500mM KCl, 15mmMgCl2, 0.1%[wt/vol] gelatin, 0.5% Tween 20）, 4μl dNTPs混合物,0.5μl 40μmol正向引物,0.5μl 40μmol反向引物,0.25μl (5U·μl-1)Taq,模板2μl,水37.75μl,总反应体系50μl;其适宜PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,94℃预变性4min,再按94℃1min～52℃0.5min～72℃1.5min进行35个循环,最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序,PCR扩增产物DNA序列与靶基因序列的同源性达99.6%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。采用PCR方法共检测了60株金黄色葡萄球菌和20株其他革兰氏阳性菌和阴性菌,结果表明60株金黄色葡萄球菌中60株均为阳性结果;20株其它菌株均为阴性结果,因此本研究选择的引物特异性强。PCR方法的灵敏度为0.675pg。 本研究对乳品中金黄色葡萄球菌DNA的6种提取方法进行了比较,确定了一种可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA的方法。该方法无需对样品进行增菌,可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA,作为模板进行PCR检测,检测效果良好。采用该方法成功地从人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪中提取了金黄色葡萄球菌的DNA,消除了PCR反应抑制因子。这种直接从乳品中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法灵敏度高,耗时短,全脂乳和脱脂乳检测的灵敏度为10cfu·ml-1,奶酪检测的灵敏度为55cfu·g-1,可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。 本研究所采用的PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与国标GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片做了比较,结果表明: PCR方法的敏感性为100%,特异性为86.7%,符合率为94.3%,检测时间为6h;petrfilm RSA方法的敏感性为100%,特异性为93.3%,符合率为97.1%,检测时间为30h;Baird-Parker R. P. F方法的敏感性为100%,特异性为93.3%,符合率为97.1%,检测时间为30h。三种方法的敏感性相同,PCR方法的特异性低于其他两种方法,PCR方法的符合率稍低于其他两种方法,但PCR方法检测时间比其他两种方法缩短了24h。