论文部分内容阅读
目的： 探讨采用超声辐照微泡介导内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell，EPC）移植归巢至大鼠移植腹主动脉的可行性及有效性，为研究干细胞治疗慢性移植物血管病奠定前期实验基础。 方法： 选取10只重量在250-300 g之间的Lewis大鼠用于EPC的提取。无菌操作下提取大鼠的股骨与胫骨、采用 M199培养基将股骨与胫骨内的骨髓液冲出、密度梯度离心法分离得到大鼠骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNC）。将MNC种植于纤维连接蛋白包被的培养瓶内，加入大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和人碱性成纤维细胞生长因子（Human basic fibroblast growth factor，bFGF）诱导其分化成EPC。采用形态观察法、免疫荧光法及摄取 Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Acetyl low density lipoprotein，acLDL）与结合FITC标记的荆豆凝集素1（Ulex europaeus agglutinin，UEA-1）法确定EPC。将含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的慢病毒在293T细胞中进行大量扩增，构建获得由慢病毒介导的转入 GFP基因的EPC细胞株，将转入报告基因的EPC培养24、48和72 h之后，分别置于倒置荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。建立大鼠腹主动脉移植模型并对其进行评价，将30只异系大鼠腹主动脉移植模型随机分成5组（Ⅰ：对照组；Ⅱ：超声+微泡组；Ⅲ：单纯 EPC组；Ⅳ：超声+EPC组；Ⅴ：超声+微泡+EPC组）。Ⅰ组输入生理盐水作为对照；Ⅱ组输入微泡溶液并采用超声辐照；Ⅲ组输入生理盐水；Ⅳ组输入生理盐水并采用超声辐照；Ⅴ组输入微泡溶液并采用超声辐照。上述方法处理结束后，Ⅰ组和Ⅱ组输入生理盐水，Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组注射输入GFP标记的EPC。处理72 h后处死所有的大鼠，置于荧光显微镜下观察血管内GFP的表达情况。 结果: ①光学显微镜下观察：培养过程中的细胞可呈短梭形、圆形和纺锤形等形态；荧光显微镜下观察：细胞 CD133和VEGFR2表面抗原的表达均为阳性；激光共聚焦显微镜下观察：MNC在培养8 d时可以同时摄取 Dil-AC-LDL与 FITC-UEA-1。以上鉴定结果表明MNC已分化成EPC。②慢病毒感染内皮祖细胞24 h后，即可看到细胞内有少量的GFP；48 h后，GFP逐渐增多；72 h后，可见所有的细胞内均呈现绿色荧光。③倒置荧光显微镜下观察到上述处理的Ⅰ组和Ⅱ组大鼠移植腹主动脉内未发现绿色荧光，Ⅲ组、Ⅳ组、和Ⅴ组大鼠移植腹主动脉内可见绿色荧光，而其中Ⅴ组中绿色荧光的强度显著高于另外两组。 结论: 上述实验结果表明：大鼠MNC在VEGF和bFGF的诱导下可分化成EPC；带有GFP基因的慢病毒可以有效地感染EPC，使其成功地表达GFP，且未对细胞活性造成明显影响；我们建立的经超声辐照微泡介导EPC移植归巢至大鼠移植腹主动脉的方法可行性高且效果明显，可作为一种新的技术手段应用于干细胞靶向治疗慢性移植物血管病临床领域的研究。