目的 后发性白内障(简称后发障)是白内障摘除术后影响视力的最主要并发症之一，虽经多年不懈努力研究，至今尚未解决。术后2～5年成人发生率高达50％，儿童更是高达100％，目前尚无有效的药物进行防治。因此，研究如何减少后发性白内障的发生，提高患者术后视力，具有重要的临床意义。 多年来，人们在不断改良人工晶状体的设计和手术技术的同时，还尝试了药物、激光、手术等多种治疗手段，但对儿童白内障和并发性白内障的效果均无法令人满意。基因治疗近年来在多种难治性疾病的防治方面取得了很大的发展，显示出其优越的先进性和较为令人满意的效果。目前，已有大量的体外实验显示，反义基因疗法可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的发生。反义c-myc基因转染对人视网膜色素上皮细胞、乳腺癌细胞、淋巴瘤细胞、肝癌细胞等的增殖均有良好的抑制作用。基于反义c-myc基因治疗抑制上述细胞增殖研究的成功经验，我们认为通过转基因技术调控细胞周期，改变细胞增殖活性，很可能是一种极有前景的防治后发性白内障的途径。 本研究通过体外、体内实验，利用转基因技术在国内外第一次将反义c-myc基因转染晶状体上皮细胞，观察其对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响，从细胞周期的改变、mRNA和蛋白质水平的变化等方面探讨其抑制后发性白内障发生的作用。反义c一myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究2004孙洁博}论文材料和方法 一、体外实验 1.293细胞及永生化人晶状体上皮细胞(HLEC)的培养 一2.两种重组腺病毒(Ad一Lacz，Ad一AS一myc)的扩增、纯化与滴度测定 3.重组腺病毒转染效率的测定 将Ad一LaeZ按MOI(感染强度，Multiplieity ofxnfeetion)100，200感染HLEe，48h后进行X一Gal染色。显微镜下观察，计算蓝染细胞占所有细胞的百分率，即为转染效率。 4.Ad一AS一myc转染对HLEC影响的检测 (l)细胞形态学改变 将Ad一As一myc按Mol 100感染HLEc，于感染后每日观察并记录细胞的形态变化，并与正常HLEC进行比较。 (2)细胞生长曲线的变化 以5 x 103个细胞/孔接种HLEC至6孔板，培养过夜。按MOI 100将Ad一AS一myc转染细胞。定期(转染后24、48、72、96h)消化收集细胞，计算细胞密度。将实验结果与对照组进行比较。 (3) MTT比色法分析细胞增殖的变化 以103个细胞/孔接种HLEc至%孔板，培养过夜。按MOI 100将Ad一AS一myc转染细胞。定期(转染后24、48、72、%h)加入MTT溶液，4h后吸弃孔内上清液，加入DMSO，振荡，在酶联免疫测定仪上检测其在492nm处的吸光值。将实验结果与对照组进行比较。 (4)流式细胞仪的检测 l)细胞凋亡的测定(Annexin一v Kit法):按MOI 1 00将Ad一AS一mye感染HLEC，48、96h后采用Annexin一v Kit法检测，MultiGraph软件分析结果。将实验结果与对照组进行比较。 2)细胞周期分析:按MOI 100将Ad一AS一myc感染HLEC，48、96h后常规DNA倍体检测，Multicycte软件分析结果。将实验结果与对照组进行比较。 (5)Rl’- PCR检测c一mye mRNA的表达反义c一myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究2004孙洁博!论文 按Mol 1 00将Ad一As一myc感染HLEc，48、96h后分别提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后进行逆转录，逆转录产物进行PCR，tubulin为内对照。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，紫外灯下观察。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结果与对照组进行比较。 (6)免疫组织化学法分析c一myc蛋白质的表达 按MOI 1 00将Ad一AS一myc感染HLEc，48h后进行免疫组化检查。将实验结果与对照组进行比较。 (7)Western Blotting分析e一mye蛋白质的表达 按MOI 1 00将Ad一As一mye感染HLEC，48、96h后提取细胞总蛋白质，用BCAProtein Assay Kit定量，蛋白质样品进行sDs一PAGE电泳，将电泳产物转至硝酸纤维膜上，按ECL蛋白分析试剂盒方法杂交。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结果与对照组进行比较。 二、体内实验 1.实验动物 对38只新西兰白兔均行单眼超声乳化透明晶状体摘除术。选用Storz Premium超声乳化仪，全部手术均获成功。 2.实验分组:随机分为四组。 A组:空白对照组10只 术毕前房注射平衡盐溶液 B组:Ad一LacZ组8只 术毕前房注射Ad一LacZ C组:Ad一AS一myc注射一次组10只 术毕前房注射Ad一AS一myc D组:Ad一As一myc注射二次组10只 术毕及术后Zd，前房注射Ad一 AS一myc 3.术后检测项目 (l)裂隙灯检查 术后第一周的每一天及14、21、28d，行裂隙灯检查，观察后囊混浊出现的时反义c一myc幕因转染抑制后发性白内障的实验不J于究2004孙洁博士论文间、形态改变以及眼内其它部位的反应情况并记录。 (2)病毒转染效率的测定 术后Zd，取B组2眼，仔细分离晶状体囊袋，X一Gal染色，显微镜下观察晶状体上皮细胞中有无蓝染的阳性细胞，计算转染效率。 (3)非靶向性转染的测定 术后Zd，取B组2眼，x一Gal染色，观察有无角膜