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基因治疗作为一种前沿的治疗手段在肿瘤治疗中发挥重要作用,而靶向基因治疗由于其良好的、有效的定向治疗作用,极低的全身反应,成为目前基因治疗研究的热点。皮瓣是整形外科的常用工具,在难愈性创面及体表肿瘤切除后的修复重建过程中发挥重要作用。通过对皮瓣进行基因修饰,使其在肿瘤创面修复中兼具抗肿瘤作用,是整形外科领域的进一步拓展。目前应用皮瓣的靶向基因治疗在整形外科领域的研究刚刚起步,相关文献报道较少。本课题在大鼠带蒂腹壁浅动脉皮瓣(Superficial inferior epigastric artery flap, SIEA flap)模型的基础上,深入探讨慢病毒载体(Lentivirus, LV)介导外源基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)经动脉介入灌注转染复合组织瓣的可行性、安全性并对其转染条件作出评价,并首次将抗肿瘤因子白介素12与慢病毒载体结合,经动脉灌注于皮瓣中,转移于局部肿瘤创面,观察其抗肿瘤效果。本课题由以下四个部分组成：1、大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注模型的制备根据我们的前期研究结果,通过灌注美兰对大鼠SIEA皮瓣血供系统进行进一步确认、研究,设计完善的手术步骤。设计大鼠带蒂SIEA岛状皮瓣,通过暂时夹闭其它分支血供,形成一封闭回路,并经SIEA灌注PBS观察对皮瓣存活的影响。结果显示,当皮瓣缺血时间在120min时,经此操作灌注PBS术后SIEA皮瓣愈合正常,光镜下检测中性粒细胞计数与对照组相比无显著差异(P>0.05)。2、慢病毒载体介导示踪基因EGFP (LV-EGFP)经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究体外转染皮瓣中的主要成分细胞：大鼠主动脉内皮细胞(Rat aortic endothelial cell, RAEC)、大鼠的皮肤成纤维细胞(Rat dermal fibroblast, RDF)、人的皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast, HDF)、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),观察不同时间、不同感染复数(Multiplicity of infection, MOI)下的转染效率和基因表达水平,寻找最佳转染复数及转染时间。结果显示,对于HDF、 HUVEC, LV-EGFP在MOI=50即可有50%以上感染率,在MOI=200时感染率可达到80%以上。对于RDF和RAEC,在MOI=200时可有70%感染率。因此,在MOI=200时对所有的细胞均具有较高的感染率,且不影响细胞活力。对于HDF和HUVEC,在MOI=200时感染2h即可达到满意效果。对于RDF和RAEC感染时间越长越好(12h之内),感染2h基本可以保证感染率在50%以上。慢病毒介导EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究：实验大鼠依据不同灌注液：LV-EGFP (1.0×108TU/ml、5.0×108TU/ml、1.0×109TU/ml)、PBS,随机分为4组。按第一部分所诉,经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣120min。术后第7、14、21、28、40天对外源基因在各组SD大鼠带蒂SIEA皮瓣的表达和分布情况进行评价。结果显示：PBS(A组)和LV-EGFP1.0×108TU/ml(B组)、LV-EGFP5.0×108TU/ml (C组)不能有效转染皮瓣。1.0×109TU/ml (D组)可以有效转染皮瓣,在术后40天仍有表达,对肝、肾无影响。3、目的基因mIL12(murine Interleukin-12, mIL12)过表达慢病毒载体构建及功能检测选取具有抗肿瘤作用的IL12作为目的基因,以pORF-mIL-12为模板,PCR调取目的基因,与表达载体重组,采用三质粒慢病毒包装系统构建重组白介素12慢病毒(LV-mIL-12).以构建好的LV-mIL-12感染人及大鼠皮肤成纤维细胞(HDF、RDF)、血管内皮细胞(HUVEC、RAEC),检测mIL-12过表达及生物活性。结果显示：成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒,能在细胞内表达。LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞,并分泌有生物活性的mIL-12。4、LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SHZ-88乳腺癌细胞的影响行大鼠SHZ-88乳腺癌细胞皮瓣皮下接种法建立大鼠乳腺癌模型,将SD大鼠经动脉灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS随机分为三组。按前文所述制备SIEA岛状皮瓣,经动脉灌注不同灌注液,分别于术后的第1~40天,观察负瘤鼠生长情况、SIEA皮瓣成活情况及局部瘤体生长情况。结果显示：在术后的28天,ELISA检测实验组皮瓣中央及皮瓣周围均有mIL12表达,皮瓣中央处表达量>皮瓣周围>对照组。经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期(7~15天)抑制了局部肿瘤细胞的生长。但到第20天后肿瘤生长实验组与对照组基本持平,肿瘤体积不再明显长大。综上所述,本实验建立了操作简便、稳定的大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注研究模型。证实慢病毒载体可以携带外源基因EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣。通过三质粒包装法成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒,构建的LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞,并分泌有生物活性的mIL-12。LV-mIL-12经动脉灌注大鼠带蒂SIEA皮瓣,可以在皮瓣及其周围组织中表达。LV-mIL12转染的大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期(7~15天)抑制了局部肿瘤细胞的生长。