寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是属于黄病毒科黄病毒属的虫媒病毒。该病毒在世界范围内广泛分布,且其感染会对人类健康造成威胁。ZIKV能通过虫媒传播,母婴传播和性传播等多种途径在人群中扩散,提示安全有效的ZIKV疫苗是预防该病毒的必要手段。截至2020年4月,世界范围内仍未有对ZIKV特效的药物和疫苗上市,在研发阶段的产品包括减活疫苗,灭活疫苗、与DNA、m RNA、以及蛋白等形式的亚单位疫苗等。病毒的性质和其他黄病毒属疫苗的研发工作为ZIKV疫苗设计提供了理论依据和宝贵经验。在登革病毒研究中,人们发现病毒感染和减活疫苗诱导的部分抗体有通过抗体依赖的增强作用增加病毒感染,加重感染症状的副作用。寨卡病毒和登革病毒有相同的病毒结构,相似的氨基酸序列,重叠的分布区域,且二者产生的抗体能相互增强另一种病毒的感染。以上现象提示一个优秀的ZIKV疫苗不仅需要有效地抑制该病毒本身,还应避免因抗体依赖的增强作用带来的风险。本团队致力于重组亚单位ZIKV疫苗的研究工作。该类疫苗不仅安全性高,而且还是研究免疫原优化策略的良好形式。在前期研究中,我们设计了包含ZIKV包膜蛋第三结构域的EDⅢ蛋白和包含包膜蛋白全部胞外域的E80蛋白。小鼠水平的评估结果显示,两种免疫原均能小鼠体内诱导中和抗体反应和抗原特异性的T细胞反应,并能在小鼠保护模型中有效抑制ZIKV的复制,减轻ZIKV感染造成的病症。在本课题中,我们进一步在非人灵长类动物模型中评估了EDⅢ和E80蛋白的免疫原性和保护性,并对其提供保护的机制进行了深入研究。免疫原性检测的结果显示,EDⅢ和E80在猴体内皆能诱导抗原特异性的抗体反应和T细胞反应,且两种免疫原诱导的抗体均能结合ZIKV病毒颗粒并在体外空斑减少中和试验中抑制ZIKV对细胞的感染。这些结果提示EDⅢ和E80免疫有在猴体内抑制ZIKV感染的潜能。基于此,我们通过攻毒实验及后续的病毒载量检测等实验评估了两种免疫原在体内的保护效价。而该实验结果的显示EDⅢ和E80在猴体内有截然不同的保护效果,即EDⅢ免疫猴体内的病毒载量并不低于PBS对照组猴,而E80免疫猴血液和组织中ZIKV的病毒载量均被有效抑制。为了探究造成上述结果的原因,我们全面比较了非保护性的EDⅢ蛋白和保护性的E80蛋白诱导的抗体反应的性质。我们通过对病毒血症数据的统计分析进一步验证了E80免疫抑制了ZIKV在猴体内的复制,而EDⅢ免疫增强了ZIKV造成的病毒血症的现象。在体外ADE实验中,我们发现EDⅢ和E80诱导的抗体在下降到一定浓度时均有造成ADE的可能。考虑到攻毒实验和免疫反应检测间有2周的间隔,我们比较了两个时间点各组猴抗原特异性抗体、病毒结合性抗体、抗体中和滴度的变化幅度。结果显示,虽然二者诱导的抗原特异性抗体的变化幅度相同,但EDⅢ诱导的病毒结合性抗体反应的可持续性低于E80蛋白诱导相应抗体,导致在攻毒实验开始时EDⅢ组猴血清对ZIKV的抑制能力显著低于E80猴血清,且处于和PBS对照组猴无显著性差别的水平。这些结果揭示了两种亚单位免疫原保护效价不同的主要原因,强调了疫苗诱导的中和抗体的数量、质量、可持续性的重要性。EDⅢ诱导抗体对抗原本身的强结合能力和对病毒颗粒的弱结合能力提示其诱导的免疫反应由不在病毒表面暴露的表位所主导。我们对抗体结合位点的进行了鉴定以确认该表位的位置。结果显示,EDⅢ诱导的抗体识别的表位覆盖了该蛋白的大部分区域,且大多不在病毒表面充分暴露。该结果表明EDⅢ蛋白的效价被其在病毒表面较低的暴露程度所限制。我们对E80免疫原诱导抗体识别的区域也进行了检测,其结果显示该蛋白诱导的抗体反应由EDI/II区域主导。在基于肽段的表位鉴定实验中,E80血清主要结合位于EDI/II区域中在病毒表面充分暴露的表位,而对EDⅢ区域仅有微量的结合且主要针对非中和抗体表位。这些结果提示E80蛋白中的EDI/II区域是在恒河猴体内诱导保护性免疫反应的关键组分。本课题还研究了EDⅢ和E80诱导的抗体与DENV交叉作用的能力。实验结果显示,仅有E80蛋白诱导的抗体能交叉结合DENV病毒颗粒,且相应抗体在体外实验中既能抑制DENV也有增强其感染的能力。该现象揭示了E80免疫原的潜在优势和风险,提示进一步优化E80免疫原以研发ZIKV/DENV广谱疫苗的可行性。综上,本研究显示E80是一个更有前景的疫苗候选者;提示疫苗诱导的病毒结合性抗体的数量,中和效价以及可持续性对疫苗的保护效价都至关重要;提示免疫原在病毒表面暴露的程度对疫苗设计有辅助性作用。这些结果对ZIKV疫苗研发,ZIKV疫苗评估指标的选择,以及亚单位疫苗的设计等多个层面都具有重要意义。