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目的:通过研究丹参素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响,探讨丹参素在动脉粥样硬化中所起的保护作用及可能机制,使中药的运用更具有现代医学的实验基础,为弘扬祖国医药学作出贡献。方法:1.大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)的原代培养和鉴定:取Wister大鼠胸主动脉,用反复贴块法培养大鼠VSMCs,用光镜和免疫组化鉴定。培养5-10代用于实验。2.氧化低密度脂蛋白的制备:将购买的低密度脂蛋白(LDL),取少量行Lowry法蛋白含量测定。采用铜离子氧化。用丙二醛(MDA)测定法测定处理前后的LDL中MDA含量以确定LDL是否氧化成ox-LDL。3.丹参素(DSS)的制备:取10 mg丹参素钠溶于5mlPBS中,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃冰箱保存备用。4.不同浓度ox-LDL对VSMCs生长的影响:取对数生长期的细胞以每孔2x104个细胞接种于96孔板中,分10组,每组六个孔。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养两天后换用无血清DMEM培养次日各组换用含5%FBS DMEM并分别处理如下:第1组不加ox-LDL;其余各组加ox-LDL,终浓度分别为20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/l,24小时后通过MTT法检测OD值。以上实验重复6次,并以每组各孔平均OD值绘制增殖曲线。5.不同浓度DSS对ox-LDL促VSMCs增殖的影响:收集细胞以每孔2 x103个细胞接种于96孔板中,分4组,每组六个孔。培养三天后(方法同前)各组分别处理如下:①5%FBS DMEM;②5%FBS DMEM+50mg/l ox-LDL;③5%FBS DMEM+50mg/lox-LDL+50 mg/L DSS;④5%FBS DMEM+50mg/l ox-LDL+100 mg/L DSS,24小时后通过MTT法检测OD值。以上实验重复三次。收集细胞以每孔6x104个细胞接种于6孔板中的四个孔中,培养三天后各孔分别处理如下:①5%FBS DMEM;②5%FBS DMEM+50mg/l ox-LDL;③5%FBS DMEM+50mg/l ox-LDL+50 mg/L DSS;④5%FBS DMEM+50mg/l ox-LDL+100 mg/L DSS,20小时后分别提取四孔中细胞m RNA ,RT反转录后c DNA经特异性引物再PCR,以GAPDH作内标,测定每组PDGF-BB m RNA的表达水平。以上实验重复三次。6.不同浓度DSS对ox-LDL促凋亡的影响:收集细胞以每孔6x104个细胞接种于6孔板中的4个孔中,培养三天(方法同前)后分别干预如下:①5%FBS DMEM;②5%FBS DMEM+100mg/l ox-LDL;③5%FBS DMEM+100mg/l ox-LDL+50 mg/L DSS;④5%FBS DMEM+100mg/l ox-LDL+100 mg/L DSS,16小时后观察各孔细胞生长形态并拍摄,收集各孔细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复6次。7.统计分析:使用SPSS统计软件11.5版本。实验结果以( x±S)表示,实验数据均采用方差分析(F检验),P<0.05:有显著性差异。结果:1.原代大鼠主动脉平滑肌细胞的培养和免疫组化鉴定:采用自行探索的反复贴块法培养细胞,血管片成功贴附,反复利用,短期内就获得了大量的细胞。贴附良好的血管片周围第3天即可见数个形态较规则的梭形细胞,有些血管片周围细胞呈辐射状生长,细胞大部分呈梭形。原代培养4-10天可见细胞不断分裂增多,有些局部细胞生长相当密集以致看不清形态。部分区域细胞生长呈特征性的“峰”和“谷”生长形态。免疫组化鉴定:荧光显微镜下可见细胞体呈长梭形,所有细胞胞浆染色棕黄色是为阳性,胞核不着色。2.原代大鼠主动脉平滑肌细胞生长特征:原代培养细胞局部生长相当密集时,即可视情况1:1或1:2传代,传代后数小时细胞即贴壁,次日可见细胞全部贴壁,第3-4天培养瓶长满细胞即可按1:3或1:4传代。3.氧化低密度脂蛋白的制备: LDL行Lowry法含量测定浓度为6.0mg/ml,体积为330μl。氧化前后的LDL行丙二醛测定含量分别为1.5μmol/L和17.2μmol/L,证实LDL已被氧化成ox-LDL[1]。4.不同浓度ox-LDL对VSMCs生长的影响:MTT实验表明低浓度ox-LDL干预下,干预浓度增加,增殖程度(以OD值表示)增加,在50 mg/l组其OD值最大,60 mg/l组OD值开始下降,100 mg/l组其OD值最小并在镜下可见细胞凋亡。以50 mg/l为增殖实验干预浓度,以100 mg/l为凋亡实验干预浓度。5.不同浓度DSS对ox-LDL促VSMC增殖的影响:MTT实验表明各组OD值有显著差异性,DSS呈剂量依赖性降低ox-LDL引起的OD值升高。RT-PCR实验表明各组PDGF-BB的表达水平有显著差异:DSS呈剂量依赖性降低ox-LDL引起的PDGF-BB的表达水平升高。6.不同浓度DSS对ox-LDL促凋亡的影响:各干预组形态学观察:①组可见典型的平滑肌细胞生长特征,细胞多为梭形呈单层束状排列;②组可见细胞胞膜模糊,变圆,细胞气泡增多;③组可见细胞变小变圆并有脱落。④组可见细胞脱落,坏死,呈现片状细胞脱失区。各组细胞凋亡指数有显著性差异:对照组无细胞凋亡,DSS呈剂量依赖性增加ox-LDL引起的凋亡指数的升高。结论:①利用自行探索的反复贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞可方便省力,节约成本,短时间获得大量细胞。②丹参素具有对抗低浓度氧化低密度脂蛋白致平滑肌细胞增殖的作用。其抗增殖作用是通过抑制血管平滑肌受损后PDGF-BB m RNA的表达水平。其抑制能力随其浓度增加而增强。③丹参素可协同高浓度氧化低密度脂蛋白促进血管平滑肌细胞的凋亡。其促进能力随其浓度增加而增强。