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目的:
建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,通过观察其细胞形态、生长方式、测量生长曲线、进行冻存复苏实验探讨其生物学特性,鉴定其多向分化能力。建立体外诱导大鼠脂肪干细胞分化为神经元细胞的方法,探讨在诱导分化过程中神经前体细胞标志nestin在诱导前后和诱导后不同时间的表达变化。希望能够证明ADSCs是一种自我复制、连续传代、具有多向分化能力、可以诱导分化为神经元细胞的成体干细胞,有希望治疗神经性勃起功能障碍,为以后的动物模型实验打下基础。
方法:
第一部分,取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录其细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第三代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行Von Kossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红0染色,通过成脂、成骨诱导鉴定其多向分化能力。
第二部分,使用诱导剂IBMX诱导ADSCs向神经元样细胞分化,观察诱导过程中细胞形态学的变化,诱导24小时后,免疫细胞化学荧光法检测神经前体细胞标志Nestin和神经元标志NF200,免疫组化法检测神经元标志MAP2,以明确分化结果,而且使用免疫细胞化学荧光法检测Nestin在诱导过程中的表达阳性率的变化情况,采用SPSS11.0软件进行统计学分析。
结果:
从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,Von Kossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红0染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有降低。
经诱导剂IBMX诱导后,ADSCs表现出神经元样细胞形态,大部分细胞表达nestin,少部分细胞表达MAP2和NF200,随着诱导的进行,nestin的表达是升高的。
结论:
成功了建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便的保存,可以作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。使用IBMX可以诱导ADSCs分化为神经元样细胞,表达神经前体细胞标记nestin和成熟神经元标志MAP2和NF200,ADSCs有希望成为治疗神经性勃起功能障碍的理想的种子细胞。