脂肪干细胞生物学特性和体外诱导成神经元样细胞治疗神经性勃起功能障碍的初步研究

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目的: 建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,通过观察其细胞形态、生长方式、测量生长曲线、进行冻存复苏实验探讨其生物学特性,鉴定其多向分化能力。建立体外诱导大鼠脂肪干细胞分化为神经元细胞的方法,探讨在诱导分化过程中神经前体细胞标志nestin在诱导前后和诱导后不同时间的表达变化。希望能够证明ADSCs是一种自我复制、连续传代、具有多向分化能力、可以诱导分化为神经元细胞的成体干细胞,有希望治疗神经性勃起功能障碍,为以后的动物模型实验打下基础。 方法: 第一部分,取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录其细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第三代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行Von Kossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红0染色,通过成脂、成骨诱导鉴定其多向分化能力。 第二部分,使用诱导剂IBMX诱导ADSCs向神经元样细胞分化,观察诱导过程中细胞形态学的变化,诱导24小时后,免疫细胞化学荧光法检测神经前体细胞标志Nestin和神经元标志NF200,免疫组化法检测神经元标志MAP2,以明确分化结果,而且使用免疫细胞化学荧光法检测Nestin在诱导过程中的表达阳性率的变化情况,采用SPSS11.0软件进行统计学分析。 结果: 从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,Von Kossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红0染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有降低。 经诱导剂IBMX诱导后,ADSCs表现出神经元样细胞形态,大部分细胞表达nestin,少部分细胞表达MAP2和NF200,随着诱导的进行,nestin的表达是升高的。 结论: 成功了建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便的保存,可以作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。使用IBMX可以诱导ADSCs分化为神经元样细胞,表达神经前体细胞标记nestin和成熟神经元标志MAP2和NF200,ADSCs有希望成为治疗神经性勃起功能障碍的理想的种子细胞。
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