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目的目前对骨质疏松症的防治问题已经引起全球的关注。迄今为止对骨质疏松症尚无特效药物。国内外实验证明,杜仲单体成分可促进成骨细胞增殖分化并可上调成骨细胞OPG/RANKL的比值,但目前对杜仲的研究多关注于杜仲整体,对其单体及化合物成分的研究较少。本实验着眼于杜仲单体成分松脂素二葡萄糖苷对MC3T3-E1成骨细胞的研究,应用松脂素二葡萄糖苷培养MC3T3-E1成骨细胞,观察其对MC3T3-E1成骨细胞的增殖分化的作用和对OPG及RANKL表达的影响,进而为松脂素二糖苷对骨质疏松症的临床应用提供依据。方法本实验从松脂素二葡萄糖苷对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化以及对其OPG以及RANKL表达的影响两部分分别进行。第一部分：各实验组细胞分别加入含不同浓度的松脂素二葡萄糖苷：0mg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml的含10%胎牛血清的培养液培养MC3T3-E1成骨细胞,用MTT法确定松脂素二葡萄糖苷培养液对MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用。然后用以上三种浓度的松脂素二葡萄糖苷培养液培养MC3T3-E1成骨细胞,检测ALP的活性,以评价松脂素二葡萄糖苷培养液对MC3T3-E1成骨细胞的分化作用。最后用茜素红染色法显微镜下观察三种不同浓度的松脂素二葡萄糖苷培养液对MC3T3-E1成骨细胞的钙化作用。第二部分：各实验组细胞分别加入含不同浓度的松脂素二葡萄糖苷：Omg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml的含10%胎牛血清的培养液培养MC3T3-E1成骨细胞,用半定量PCR法观察三种不同浓度的松脂素二葡萄糖苷培养液对MC3T3-E1成骨细胞的OPG和RANKL的转录情况,评价松脂素二葡萄糖苷培养液对MC3T3-E1成骨细胞OPG及RANKL表达的影响。结果第一部分：(1)不同浓度的松脂素二葡萄糖苷培养液培养期间,MC3T3-E1成骨细胞生长状态良好,未出现细胞大量死亡的情况。(2)MTT显示10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml用药各组与DMSO对照组和空白组比较,均能促进MC3T3-E1的增殖,且差异具有显著性(P<0.01)。(3)松脂素二葡萄糖苷用药各组与空白对照组以及DMSO对照组相比较,均能促进MC3T3-E1成骨细胞分泌ALP,且具有显著性差异(P<0.05),呈浓度依赖性。10-7mg/ml组的ALP含量明显高于空白组和DMSO组,差异具有显著性(P<0.01)。(4)松脂素二葡萄糖苷培养液培养14天后,茜素红染色结果显示用药各组染色较深,钙结节含量丰富,而对照组及空白组染色较浅,钙结节含量少,提示松脂素二葡萄糖苷能够促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。第二部分：(1)不同浓度的松脂素二葡萄糖苷培养液培养期间,MC3T3-E1成骨细胞生长状态良好,未出现细胞大量死亡的情况。(2)通过对MC3T3-E1OPG mRNA表达的半定量RT-PCR检测发现,用药各组与空白组及对照组相比较,光密度值明显增加,差异具有显著性(P<0.05),且随着药物浓度的增加,OPGmRNA的水平逐渐增加,提示松脂素二葡萄糖苷可以促进MC3T3-E1OPG mRNA的表达,且具有浓度依赖性。(3)通过对MC3T3-E1RANKL mRNA表达的半定量RT-PCR检测发现,用药组与与空白组及对照组相比较,光密度值明显降低,差异具有显著性(P<0.05),且随着药物浓度的增加,RANKL mRNA的水平逐渐降低,提示松脂素二葡萄糖苷可以促进MC3T3-E1OPG mRNA的表达,且具有浓度依赖性。结论本实验通过MTT法及检测ALP的活性和茜素红染色,证明了松脂素二葡萄糖苷对MC3T3-E1成骨细胞分化成熟及增殖所起到的重要作用。并且松脂素二葡萄糖苷可通过促进成骨细胞表达OPG,并抑制其表达RANKL,进而抑制破骨细胞的分化与成熟；同时进一步研究了随着药物浓度的增加,OPG mRNA的表达逐渐增加而RANKL mRNA的表达逐渐减少,为筛选促进骨形成的有效药物提供了作用靶点,从而有望发挥松脂素二葡萄糖苷乃至植物雌激素类药物对骨质疏松症的治疗作用。