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食物过敏是一种全球性的食品安全问题,其中水产品过敏的人群比例为2.4%,且仍有不断上升的趋势。南美白对虾(Litopenaeus vannamei)中的主要过敏原为原肌球蛋白(Tropomyosin,TM),会引起IgE介导的速发型超敏反应。研究表明双歧杆菌和乳酸菌能通过重建肠道菌群结构、影响肠道代谢、调节肠道免疫等作用抑制炎症反应、缓解食物过敏,但其具体机制尚未完全阐明。鉴于此,本文以南美白对虾为原料,结合硫酸铵沉淀法、等电点沉淀法等分离提纯出主要过敏原TM,通过液质连用技术鉴定TM并用BCA法测定其浓度。以纯化的TM为过敏原,腹腔注射6周龄Balb/c雌、雄小鼠,从第14天开始给致敏组口服灌胃长双歧杆菌婴儿亚种1.2202(Bifidobacterium longum subsp.)或芽孢乳酸菌09.712(Bacillus coagulans 09.712),从小鼠体重变化、腹泻及过敏症状评分、血清中组胺、IgE含量变化以及脾细胞培养上清中细胞因子确定TM致敏最佳剂量,构建TM致敏及益生菌治疗小鼠模型。通过氯乙酸萘酚酯酶染色、PAS特殊染色法检测各组别小鼠肠道部位的肥大细胞和杯状细胞;通过免疫组化法检测各组别小鼠肠道部位的CD4+ T细胞和嗜酸性粒细胞;通过TUNEL法检测肠道部位凋亡细胞。同时检测小肠、大肠、脾脏相关基因mRNA的表达量。通过以上指标探究肠黏膜免疫在TM致敏及益生菌缓解TM致敏作用的机理。通过GC-TOF-MS法检测小鼠肠道内容物中的代谢产物;筛选出主要差异代谢产物;通过肠道内容物16S rDNA测序检测小鼠肠道中的菌群分布与丰度。主要研究结果如下:1.当抽提液pH6.5～7.5、硫酸铵饱和度30%、抽提时间为2天时,可以有效分离纯化TM,得到高纯度的TM;经液质联用鉴定该蛋白为Litv 1 tropomyosin(Litopenaeus vannamei)分子量为32.8kD,等电点为4.75;BCA法测定其浓度最高可达43μg/μL;2.以TM为过敏原,不同剂量腹腔注射致敏雌、雄小鼠,发现雌性小鼠在致敏期间体重变化更为显著,过敏症状更为明显;且只在雌性小鼠血清中检测到IgE,其含量随着剂量的增加而增高;雌性小鼠HIS含量高于雄性小鼠;脾细胞培养上清中Th2型细胞因子(IL-4)含量高于雄性小鼠,Th1型细胞因子含量(IL-10、IFN-γ)低于雄性小鼠。以上结果表明雌性小鼠高剂量TM致敏模型构建成功,雌性小鼠相较于雄性小鼠更适合构建TM过敏模型;3.给不同剂量TM致敏组Balb/c小鼠从第14天开始口服灌胃长双歧杆菌婴儿亚种1.2202或芽孢乳酸菌09.712,小鼠过敏症状减轻,血清中IgE、组胺含量下降,Th1型细胞因子增加,Th2型细胞因子减少,表明这两种益生菌都能在一定程度上缓解TM过敏,TM治疗模型构建成功。4.通过对Balb/c致敏及治疗模型组小鼠肠道形态组织学观察可知,TM致敏组小鼠肠道发生组织病变,主要表现在肠绒毛排列紊乱,肠绒毛脱落至肠腔,局部出现溃疡,黏膜基层变厚等组织病变。过敏相关细胞如杯状细胞、肥大细胞、CD4+T细胞增加,嗜酸性粒细胞浸润,部分细胞开始凋亡。病变部位主要集中在小肠,结肠基本不受影响。长双歧杆菌婴儿亚种1.2202和芽孢乳酸菌09.712均能够缓解TM引起的肠道组织病变。5.通过GC-TOF-MS法检测小鼠肠道内容物中的代谢产物,对各组小鼠肠道内容代谢产物进行PCA主成分分析、OPLS-DA分析、热图分析、气泡图分析等可知:TM使雌性Balb/c小鼠精氨酸代谢失调,产生过敏反应。芽孢乳酸菌09.712可以通过精氨酸代谢途径缓解小鼠过敏,其主要涉及谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代谢等代谢通路等。6.通过16S扩增子测序可知TM致敏可能与小鼠肠道菌群结构变化相关:TM致敏组小鼠乳酸菌科(Lactobacillaceae)、拟杆菌科(Bacteroidales)比例显著下降;毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)显著上升;可知肠道菌群结构改变可能是导致TM过敏的原因之一。长双歧杆菌婴儿亚种1.2202和芽孢乳酸菌均能够缓解TM引起的食物过敏,但其作用机制存在一定区别。芽孢乳酸菌可能通过回调小鼠乳酸菌科(Lactobaacillaceaae)、拟杆菌科(Bacteroidales)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)缓解TM过敏;双歧杆菌可能通过增加肠杆菌科(Enterobacteriaceaae)菌群比例来抑制TM过敏。综上所述可知:TM可能通过改变肠道菌群及其代谢通路,引起肠黏膜免疫反应,破坏Th1/Th2平衡,使平衡朝Th2极化。以上研究结果为TM致敏及益生菌调控TM过敏的机理研究提供了有利的理论基础并为食物过敏的防治提供潜在的靶点。