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真菌次级代谢产物种类繁多,结构复杂,许多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等广泛的生物活性,是药物开发的重要源泉。但一般来说,真菌次级代谢产物产量较低,直接从生产菌株的发酵物中分离次级代谢产物的工作量大,效率低。合成生物学是近年来发展起来的一门新兴交叉学科,利用分子生物学技术对次级代谢产物的代谢途径进行遗传操作,把生物合成基因簇转到异源宿主中进行高效表达,有望获得次级代谢产物的高产菌株。构巢曲霉Aspergillus nidulans是丝状真菌表达系统中的常用模式菌株,遗传背景清晰,遗传操作技术相对成熟,适合用于真核生物天然产物的异源表达研究。将目标基因簇转到A.nidulans中表达,可以鉴定化合物的生物合成基因簇、创造新的次级代谢产物和提高次级代谢产物产量。本论文研究对象为自中国西藏自治区藏药材大花绿绒蒿中分离得到的真菌Neonectria sp.DH2。该菌能够合成多种活性次级代谢产物,其中包括化合物ilicicolin H。Ilicicolin H是一种聚酮杂合非核糖体肽合成酶的天然产物,具有潜在的广谱抗真菌活性,对Candida spp.,A.fumigatus和Cryptococcus spp.等均具有显著的抑制作用,其中对隐球菌属Cryptococcus真菌的最小抑菌浓度与卡泊芬净、氟康唑等抗真菌药相当,在临床应用上具有很好的发展前景。目前对于ilicicolin H生物合成的基因簇尚没有报道,所以本研究通过在A.nidulans异源表达来鉴定ilicicolin H生物合成的基因簇,运用生物信息学方法预测ilicicolin H的生物合成途径,在合成基因前加入强启动子xylP和adgA提高其在异源表达菌株中的产量。具体的研究内容如下:首先,对产ilicicolin H的野生型菌株Neonectria sp.DH2进行基因组测序,分析基因组序列,运用antiSMASH工具预测DH2中生物合成相关的基因簇,结合基因注释和同源序列比对的结果,推测DH2基因组中含有47个可能与次生代谢相关的基因簇（gene cluster）,其中Cluster 3可能为合成ilicicolin H的生物合成基因簇。然后,利用载体pRG-AMA1构建含有Cluster 3核心基因orf7-11的表达质粒pDH01,通过PEG介导的原生质体转化技术将重组质粒pDH01整合到A.nidulans中,获得阳性转化子DH01。将A.nidulans、携带空载体pRG-AMA1的转化子DH00和转化子DH01一起进行液体发酵,用乙酸乙酯萃取发酵液,运用HPLC-MS进行分析。结果显示DH01样品中检测到ilicicolin H,同时还有ilicicolin H的同系物。通过核磁共振技术,进一步确定后者的结构为8,9-dehydro-ilicicolin H,命名为 ilicicolin J,为一个新的化合物。因此 DH2 中Cluster3可以鉴定为ilicicolin H生物合成相关的基因簇,orf7-11命名为iliA-E。接着构建了 3个重组质粒pDH02（含有基因iliB和iliC）、pDH03（含有基因iliB、iliC 和 iliD）和 pDH04（含有基因 iliB、iliC、iliD 和iliE）,只有 pDH04 产生了异源表达的产物,因此iliA在ilicicolin H生物合成中没有起到直接的作用,而没有iliE参与则无法形成ilicicolin H。通过与已报道的tenellin生物合成途径相比对,预测了基因iliA-E的功能及ilicicolin H的生物合成途径。其中iliD可能编码一个S-adenosyl-L-methionine（SAM）依赖型甲基转移酶,在ilicicolin H生物合成途径中参与Diels-Alder反应（环加成反应）,这是在真菌次级代谢产物生物合成领域中发现的少有的可以催化Diels-Alder反应的酶。丝状真菌在表达外源蛋白的时候产量通常很低,已有文献报道了可以使用强启动子来增强外源蛋白表达。本研究使用葡萄糖苷酶的强启动子adgA和木糖诱导型的启动子xylP来联合促进ilicicolin H生物合成相关基因的表达,从而提高ilicicolin H的产量。与仅转化ilicicolin H生物合成基因簇的A.nidulans转化子相比,加入强启动子后ilicicolin H产量提高了 3.23倍,最高可以达到2.33mg/L。为了摸索出更适合的发酵培养基的成分,对培养基中的碳源进行优化,结果表明在含有1%木糖的培养基中ilicicolin H的产量最高,达到3.87mg/L。本研究通过在A.nidulans中异源表达基因簇成功鉴定了 ilicicolin H的生物合成基因簇,并且通过加入强启动子和优化培养基的成分提高了该化合物的产量。研究结果丰富了当前对ilicicolin H生物合成途径的认识,为深入阐明这类化合物结构的组装机制以及工程改造获得新的衍生物奠定了基础。另一方面,发现的新颖的ilicicolin同系物对后续创新药物的研究具有重要的意义。