研究背景：鼻咽癌为我国最常见的恶性肿瘤之一,源自鼻咽粘膜上皮细胞的恶变,是头颈部肿瘤一个比较明确的亚类。鼻咽癌有着独特的流行病学、临床特点、组织病理学以及病因学,它的发生、发展、临床表现及相应的治疗与其他头颈部肿瘤有一定的区别,好发于东南亚、我国的南方及香港地区,在这些地区每年的发病率高达20/100000。越来越多的证据表明鼻咽癌的与多种因素有关,包括遗传学因素、EB病毒感染、吸烟、饮酒、中草药的使用及环境因素。依据世界卫生组织的病理学分类,鼻咽癌被划分为三类：角化鳞状上皮,非角化型,未分化型。鼻咽癌病理类型以未分化鳞癌为主,主要通过淋巴结转移到颈部淋巴结,也可通过血液转移至肝、肺、骨。尽管作为鼻咽癌的标准治疗放射治疗,在早期鼻咽癌中取得了满意的效果,能极大地提高总生存期及无病生存期,但是对于中晚期患者,放化疗综合治疗却并未取得理想的效果,许多病人出现放化疗的抵抗,并且毒副作用较重,最终产生转移或复发。因此,有必要寻找更加有效有针对性的药物,同时探讨可能的作用机制,更好地治疗鼻咽癌。盐霉素(Salinomycin, Sal),又名沙利霉素,为一种聚醚类抗生素,常被用作饲养家禽以提高营养摄取率,近年来研究表明相比传统的乳腺癌常规化疗药紫杉醇,盐霉素能有效降低乳腺癌干细胞的比例,在体内,其还能抑制乳腺癌细胞的生长、降低微球形成比例及抑制淋巴结转移。进一步研究表明,盐霉素还能通过多种机制降低某些肿瘤的恶习程度,诱导这些肿瘤细胞产生凋亡,在杀伤肿瘤细胞方面表现出高效性,同时不影响正常细胞的生长。然而目前有关盐霉素对鼻咽癌影响的报道甚少。故本研究拟观察盐霉素在体内外对鼻咽癌细胞的生长抑制作用,并对其作用机制进行初步探讨,从而为盐霉素应用于鼻咽癌治疗提供可能的思路。肿瘤的发生发展离不开各种信号通路的激活或异常改变。研究表明Wnt/β-catenin信号通路在机体细胞的发育、再生及组织的稳态等方面有着重要的作用。越来越多的证据表明Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与多种肿瘤的产生密切相关,包括头颈部肿瘤、乳腺癌、肝癌、肠癌及肺癌等人类肿瘤。P-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信号通路中一个关键的中介物。异常的Wnt表达会导致P-catenin在细胞质中积累,并进入细胞核,与T细胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)结合,调节靶基因的表达,TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子,若结合P-catenin则促进基因转录。LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白,LDL-receptor-related protein, LRP6)作为Wnt/β-catenin通路中的另外一个受体,属于单次卷曲的跨膜受体,对于Wnt信号转导起着重要作用,其磷酸化能导致β-catenin复合物的破坏、P-catenin蛋白的胞内聚集以及核转位,最终导致Wnt靶向基因的表达,从而引起细胞的凋亡、粘附及周期等方面的改变。尽管Wnt信号通路参与鼻咽癌的发生发展的具体机制还有待进一步阐明,但是越来越多的证据表明P-catenin蛋白异常表达与鼻咽癌的不良预后密切相关。研究目的：本实验以人鼻咽癌细胞株CNE-1(高分化细胞)、CNE-2(低分化细胞)、CNE-2/DDP(低分化耐药细胞)作为研究对象,分析盐霉素对鼻咽癌细胞活力和侵袭能力的影响；在体外,从定性和定量两方面观察和分析盐霉素作用鼻咽癌细胞后是否有凋亡现象的产生及程度分析,从而进一步分析盐霉素介导的鼻咽癌细胞的凋亡途径及凋亡机制;在体内,建立鼻咽癌CNE-2细胞的移植瘤模型,观察用药后移植瘤的生长情况及蛋白表达情况,分析Wnt信号通路的变化。从而为盐霉素的进一步研究与临床应用提供实验依据,并奠定理论基础。实验方法：1.CCK-8实验研究盐霉素作用鼻咽癌细胞24h、48h和72h后,三株鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP的体外增殖情况,计算存活率,并选取合适的低、高两个药物浓度作为后续研究。2.侵袭实验研究不同浓度盐霉素(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后的细胞侵袭能力的改变。3. Hoechst33258荧光染色法观察不同浓度盐霉素(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后细胞核形态的变化,从形态学和定性上观察凋亡现象。4.采用流式细胞术,利用annexin-V/PI试剂盒中的荧光探针来检测不同浓度药物(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后细胞凋亡的情况。5.荧光分光光度计分析不同浓度盐霉素(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后细胞caspases酶活性的改变。6.采用流式细胞术,运用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测不同浓度盐霉素(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后细胞的线粒体活性,从而更进一步了解盐霉素介导的鼻咽癌的凋亡途径。7. Western blot实验检测不同浓度盐霉素(对照组,低浓度组,高浓度组)作用鼻咽癌细胞48h后细胞凋亡蛋白家族Bcl-2、Bax及Wnt家族蛋白LRP6、β-catenin蛋白表达变化。8.建立盐霉素治疗鼻咽癌CNE-2细胞移植瘤模型,观察和比较对照组和药物组作用裸鼠后移植瘤的生长情况,同时隔天测量裸鼠体重和皮下移植瘤的体积,绘制生长曲线；此外,将剥离下来的瘤组织进行免疫组化实验,检测和比较两组的β-catenin蛋白表达情况。实验结果：1.CCK-8法体外增殖实验显示浓度分别0,1,2,4,8and16μM盐霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞24h、48h和72h后,可见细胞的生长都受到抑制,细胞活力下降。对于每种细胞,不同浓度及不同作用时间引起的细胞活力改变具有统计学意义(P<0.05)。当8μM的盐霉素作用鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞48h后,相比对照组,细胞的存活率分别为53%,48%,42.3%。当16μ,M的盐霉素作用鼻咽癌CNE-1细胞72h后,细胞抑制率达到70%以上。2.侵袭实验显示,与对照组相比,盐霉素作用于鼻咽癌CNE-1、CNE-2、 CNE-2/DDP细胞48h后的侵袭能力下降,且呈浓度依赖性；相比对照组及低浓度药物组(8μM),高浓度药物组(16μM)作用鼻咽癌细胞时,穿越至纤维膜下层的细胞明显减少。3.Hoechst33258荧光染色法显示,盐霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、 CNE-2/DDP细胞48h后,镜下观察到对照组细胞染色质均匀,淡蓝色的细胞核形态规则。药物组则可见明显核固缩、碎裂,染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡特征,且高浓度组更加明显。4. Flow cytometry (FCM)检测凋亡率显示,与对照组相比,盐霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞48h后,凋亡细胞增加,凋亡率增加,且呈浓度依赖性。当高浓度盐霉素(16μM)作用CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞48h后其凋亡率分别为36.2%、32.1%、33.4%。5.荧光分光光度计法检测结果显示,与对照组相比,盐霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞48h后,明显增加了caspase-3和caspase-9活性,且呈剂量依赖性,然而对caspase-8影响不大。当16μM的盐霉素作用鼻咽癌CNE-1细胞48h后,caspase-3的活性增加高达5倍。6.线粒体膜电位(MMP)通过JC-1染色及流式细胞术来检测。通过比较代表正常线粒体条件下的红色荧光(FL2-H)和代表被破坏线粒体的绿色荧光(FLl-H)的比值比来对MMP进行量化。按照JC-1试剂盒说明书,我们检测到,相比对照组,盐霉素作用鼻咽癌细胞后能降低MMP,说明盐霉素作用后的细胞线粒体活性受损。7. Western blot检测结果显示,与对照组相比,盐霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP细胞48h后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量下降,促凋亡蛋白Bax的表达量增加,且均呈剂量依赖性,组间差异具有统计学意义(P<0.05)；此外,在相同药物作用条件下,我们探讨了Wnt家族的关键靶分子蛋白β-catenin及LRP6的表达情况,结果显示,这两个蛋白的表达量均下降,且呈剂量依赖性。8.体内移植瘤实验可观察到,通过测量移植瘤的体积大小,我们可以看到相比对照组,药物治疗组的肿瘤生长变慢,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。经过两周的药物治疗,实验被终止,剥离瘤体,称重量,可以发现,药物治疗组的瘤体比对照组要小,差异同样具有统计学意义(P<0.05)。通过HE染色及免疫组化技术,我们分别检测了两组瘤体组织中β-catenin蛋白的表达,结果显示药物治疗组中的β-catenin蛋白表达比对照组低,差异具有统计学意义(P<0,05)。实验结论：盐霉素可以抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭能力。在体外,盐霉素能阻断Bcl-2/Bax复合物,导致细胞凋亡率的增加、caspase-3and caspase-9激活以及线粒体膜电位的下降。此外,盐霉素在体外能降低β-catenin and LRP6蛋白的表达,在体内能抑制鼻咽癌细胞的生长,降低组织中P-catenin蛋白表达。因此我们认为盐霉素在体内外都能抗鼻咽癌细胞,这一过程可能为Wnt/β-catenin信号通路的抑制所介导。