糖尿病目前已成为全球范围内危害人类健康的主要疾病之一，糖尿病及其并发症的防治不仅仅是发达国家，而且也已经成为包括我国在内的发展中国家医学领域中亟待解决的重要问题，糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管病变之一，随着病程的进展，可由单纯型发展为伴发新生血管形成为特征的增殖型，出现眼内出血、牵拉性视网膜脱离、新生血管性青光眼等一系列严重并发症，严重的危害视觉功能，极大的影响着患者的生存质量，目前糖尿病视网膜病变已逐渐成为世界首位的成年人致盲性眼病。 健全或者维护视网膜屏障屏障，特别是内屏障的功能，无疑是延缓糖尿病视网膜病变发生和发展的重要策略！可在以下三个层面进行研究：1.从基因水平上探讨健康基因的作用以及基因多态性与疾病的易感性之间的关系；2.从糖尿病视网膜病变发病的病理生理机制上，如抗氧化损伤等，探索可能的保护策略；3.对于血视网膜内屏障本身的结构进行生理维护或者重塑。 第一部分视网膜微血管内皮细胞分离、培养、纯化和鉴定 目的：体外培养、鉴定、纯化人视网膜微血管内皮细胞，为体外视网膜内屏障模型的建立提供前提条件。 方法：2％胰蛋白酶和0.1％Ⅰ型胶原酶消化人视网膜，在P0或者P1代存在明显内皮细胞样克隆时，应用低于常规消化细胞的胰酶(0.1％)进行消化，选择性的吹打收集进行传代纯化，培养条件同既往本实验室报道的方法。 结果：经过内皮样克隆的选择性培养，联合低酶消化传代可以得到纯度达95.8％的视网膜微血管内皮细胞，并经过vWF、CD31阳性表达，LDL吞噬实验以及Tube formation等多个指标进行鉴定。 结论：改良的内皮细胞的培养方法可获得大于95％纯度的hRMECs，为视网膜体外内屏障的建立提供条件。 第二部分视网膜内屏障模型的建立以及评价 目的：探讨体外培养的人视网膜微血管内皮细胞屏障建立的方法。 方法：第4代细胞接种于Polyester(PET)膜上，不同时间点对滤膜表面行相差显微镜观察，通过紧密连接相关蛋白Occludin的表达间接反映细胞之间紧密连接的形成，应用共聚焦免疫荧光显微镜观察2、3、4周Occludin表达的变化；跨膜电阻(TER)检测屏障的稳定性，并通过测量正常培养条件和5ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)干预下辣根过氧化物酶(HRP)通透性的改变反映屏障特性。 结果：细胞接种1周后融合为单层，接种后2、3、4周细胞密度无明显变化，细胞接触紧密，呈单层生长，可见Occludin在细胞相邻边界规则的表达；Occludin在2、3、4周，在细胞内的分布逐渐移向相邻细胞交界处；2周时视网膜微血管内皮细胞跨上皮细胞电阻达123.33±5.18Ω/cm2，2、3、4周差异无统计学意义(P>0.05)；单层细胞的通透性检测结果显示，HRP从滤膜上方到达下方随时间延长呈线性增加，且在VEGF的干预下，各时间点通透率明显增加(P<0.05)。 结论：首次利用体外培养的人视网膜微血管内皮细胞建立了体外屏障模型，并证实具有典型的屏障功能特性，可作为体外研究血视网膜内屏障的有用模型。 第三部分 rAAV—NTF2对糖尿病视网膜病变血视网膜内屏障的影响 一.rAAV—NTF2对视网膜微血管内皮细胞的转染以及对细胞的影响 目的：观察rAAV—NTF2对视网膜微血管内皮细胞的转染效率以及对正常培养条件下视网膜微血管内皮细胞损伤的影响。 方法：P4代细胞进行转染，激光共聚焦显微镜下观察EGFP阳性细胞，RT—PCR检测转染前后NTF2的mRNA改变。应用流式细胞仪Annexin V—PI双染检测正常条件下rAAV2-NTF2对细胞损伤的影响。 结果：rAAV2-EGFP转染后24h，激光共聚焦扫描显微镜观察可见大量EGFP阳性细胞，rAAV2-NTF2转染组NTF2在mRNA水平明显高于空白对照组。流式检测结果组间未见明显统计学差异(P>0.05)。 结论：rAAV2-NTF2可成功高效转染视网膜微血管内皮细胞；构建的病毒载体rAAV2-NTF2对正常培养下的细胞无明显的损伤。 二.rAAV—NTF2对高糖条件下体外视网膜内屏障功能的影响 目的：探讨rAAV—NTF2对高糖条件下视网膜内屏障体外模型的影响 方法：实验分为三组：2周屏障形成后分为三组：正常培养组，30mmol/L葡萄糖干预组：30mmol/L葡萄糖+rAAV—NTF2转染组，干预24h。免疫荧光显微镜观察三组Occludin的表达，并用Western blot比较表达的差异；分别测定TEER，并应用HRP通透性试验评价15min、30min、45min、60min时屏障的通透性。 结果：2周时屏障形成良好，三组紧密连接相关蛋白Occludin均有表达，但高糖24h可见表达降低，而正常培养组和rAAV—NTF2转染组可见Occludin更为规则在细胞之间连接处的表达；正常组TEER为119.95±3.65Ω/cm2，单纯高糖干预组为90.07±6.83Ω/cm2，rAAV—NTF2转染高糖干预组114.91±5.83Ω/cm2，三组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，两两比较高糖组和其余两组差异均具有统计血意义，而正常培养组和转染组之间无明显的统计学意义；三组HRP通透性实验：正常VS高糖VS转染组(15分钟：0.372±0.045vs0.681±0.076vs0.387±0.046；30分钟0.578±0.062vs0.858±0.091vs0.608±0.078；45分钟0.811±0.103vs1.176±0.098vs0.855±0.084；60分钟1.148±0.101vs1.329±0.116vs1.210±0.098，统计学分析：各时间点三组差异具有明显的统计学意义(P＜0.05)，两两比较高糖组和其余两组差异均具有统计学意义，而正常培养组和病毒转染组之间差异无明显的统计学意义，提示转染组屏障功能良好。 结论：rAAV—NTF2对高糖条件下视网膜内屏障功能的降低具有一定的抵抗作用。 三.rAAV—NTF2对STZ糖尿病大鼠视网膜Occludin的影响 目的：进一步探讨rAAV—NTF2高表达对STZ糖尿病大鼠视网膜病变的影响。 方法：造模方法见1，提取单纯糖尿病模型组(D组)，玻璃体腔注射空载体的糖尿病视网膜病变模型组(D+EGFP组)，玻璃体腔注射rAAV—NTF2的糖尿病视网膜病变模型组(D+NTF2组)，以及正常对照组(N组)大鼠视网膜总RNA，通过RT—PCR，检测Occludin mRNA的表达变化，应用Western blot检测四组蛋白水平上的表达差异。 结果：实时定量PCR和蛋白水平上均表明，rAAV2-NTF2转染组可增加STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜Occludin的表达。 结论：rAAV2-NTF2可上调紧密连接蛋白Occludin的表达，结合前期实验结果提示rAAV2-NTF2高表达可增加STZ诱导的大鼠糖尿病视网膜病变屏障功能。 第四部分新一代线粒体靶向保护多肽SS31对高糖条件下体外视网膜内屏障功能的保护 目的：观察新一代线粒体靶向保护多肽SS31对高糖培养条件下视网膜微血管内皮细胞的保护作用以及对体外屏障功能的影响。 方法：对人视网膜微血管内皮细胞进行原代培养并鉴定，选用第四代细胞进行实验，实验分为三组：正常培养条件组；30mmol/L葡萄糖干预组；30mmol/L葡萄糖+SS31药物保护组，干预24、48h，应用Annexin V+PI测定细胞凋亡，JC-1染料法流式测定细胞膜电位变化；共聚焦显微镜测定活细胞ROS的产生以及细胞色素C的释放，通过TEER和HRP通透性实验检测对视网膜体外内屏障模型的影响。提取各组RNA，荧光实时PCR检测Trx2的表达，并应用Western blot在蛋白水平上检测Caspase3的表达，初步探讨SS31在高糖条件下对视网膜微血管内皮细胞的保护机制。 结果：24h、48h Annexin V+PI双染流式凋亡检测，药物保护组和高糖干预组差异具有显著性(p<0.01)；药物保护组可有效的对抗高糖诱导的线粒体膜电位的下降以及线粒体ROS的产生和细胞色素C的释放。对于2周时高糖干预24小时屏障的影响，TEER以及各个时间点的HRP通透性实验结果进行统计学分析，三组差异具有统计学意义(P<0.05)，两两相比，高糖联合SS31组与正常组相比无明显统计学差异，但均与高糖组相比差异具有统计学意义。药物干预组Caspase—3蛋白表达水平均降低而Trx—2 mRNA表达水平显著升高。 结论：新一代线粒体靶向保护多肽对高糖条件下视网膜微血管内皮细胞具有保护作用，并可提高体外屏障功能，提示对早期糖尿病视网膜疾病的高糖毒性具有防治作用。其作用机制可能与调控Trx—2信号通路有关。