第一部分:正常盆神经节膀胱支配神经元的电压门控钠通道电生理特性研究【目的】研究急性分离的成年大鼠盆神经节(MPG)膀胱支配神经元的电压门控钠通道(VGSCs)电生理特性,为排尿反射的机制研究奠定一定基础。【方法】采用荧光金(FG)对盆神经中膀胱支配神经元进行逆行神经追踪标记,然后采用全细胞膜片钳方法对标记神经元VGSCs的稳态激活,失活以及恢复动力学等电生理特性进行研究分析。【结果】1.MPG中膀胱支配神经元其正常的神经元为圆形或类圆形,直径16～38μm,平均直径24.28±3.28gm(n=46)。在钳制电压为-80 mV时,其平均膜电容为24.05±3.31 pF。2.保持钳制电压为-80 mV,且细胞外液中含钠离子120 mM时,MPG中膀胱支配神经元VGSCs电流(INa)于-20 mV时达到的最大电流密度,其平均电流密度为-165.13±13.51 pA/pF(n=29),此电流能被1μM TTX完全阻断,并具有可逆性。此INa稳态激活的阈电位平均为-33.79士1.82 mV(n=29),达到最大电流的膜电位约为-20 mV(平均-19.65±0.78 mV,n=29),反转电位(Vrev)约为+55 mV。半激活电压(V1/2)为-25.70±0.95 mV,其斜率因子(VC)为2.55±0.42 mV。3.MPG中膀胱支配神经元INa的稳态失活在去极化超过-80 mV时出现,其半失活电压(V1/2)为-39.92±0.79 mV,斜率因子(VC)6.93±0.46 mV(n=31)。4.MPG中膀胱支配神经元VGSCs的恢复时间常数为2.85±0.12 ms(n=23)。【结论】本研究验证了全细胞膜片钳记录联合逆行神经追踪技术,对荧光标记的自主神经节神经元的电生理特性进行研究的可能性。电生理结果表明此类神经元与交感和副交感神经元均有一定差异,它具有自己特殊的电生理特性。这些结果对进一步研究MPG中膀胱神经元的VGSCs在排尿反射过程中尤其是病理状态下的的作用及调节可能性奠定了重要的基础。第二部分:正常盆神经神经元电压门控钠通道亚型研究【目的】研究急性分离的成年大鼠盆神经节中的电压门控性钠通道的亚型分布,为进一步阐明排尿反射机制的研究及相关临床疾病的治疗建立一定基础。【方法】采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及基因测序的方法对盆神经节神经元钠通道亚型分布进行鉴定研究。【结果】本研究结果显示在MPG组织中未见Navl.2,Navl.3,Navl.8,Navl.9的表达,仅存在Navl.1,Navl.6,Navl.7的表达,且全部为TTX敏感性VGSCs。【结论】MPG中存在的三个钠通道亚型Navl.1,Navl.6,Nayl.7,可能参与了正常排尿反射,控制逼尿肌的运动功能。第三部分:人工体神经-内脏神经反射弧建立后盆节神经元钠通道变化【目的】检测人工体神经-内脏神经反射弧建立后的大鼠盆神经节(MPG)膀胱支配神经元的VGSCs电生理特性改变,为进一步阐明该反射弧机制提供一定基础。【方法】采用荧光金(FG)逆行神经追踪和全细胞膜片钳记录方法对对照组、7天组和模型组中膀胱支配神经元VGSC的电生理特性进行研究,统计分析其差异性。【结果】1.对照组、7天组和人工反射弧模型组的MPG膀胱支配神经元,平均直径24.58±2.08、25.87±1.38、24.07±1.42μm。在钳制电压为-80 mV时,三组平均膜电容分别为25.21±0.47、26.12±0.43和23.90±0.47 pF。与对照组相比,统计未见显著性差异(P>0.05)。2.对照组、7天组和人工反射弧模型组的MPG膀胱支配神经元INa阈电位约分别为-33.79±1.82 mV、-34.5±2.04 mV,-34.78±2.50 mV达到最大电流的膜电位分别为-19.65±0.78 mV、-21.05±1.03 mV、-19.13±0.87 mV。其最大电流密度均值分别为-165.13±13.51 pA/pF、-127.34±4.81 pA/pF、-152.13±14.38 pA/pF。统计显示7天组与对照组电流密度比较P<0.0 1,模型组与对照组电流密度比较P>0.05。三组达到最大电流幅值时的膜电位和阈电位之间未见显著性差异。3.对照组、7天组和模型组的半激活电压(V1/2)分别为-25.70±0.95 mV、-25.19±0.72 mV,-24.29±0.68 mV,曲线的斜率因子(Vc)分别为2.55±0.42 mV,2.35±0.33 mV,1.91±0.23 mV。与对照组相比,半激活电压和斜率因子未见明显差异。4.对照组、7天组和模型组MPG的VGSCs半失活电压分别为-39.92±0.79 mV,-37.06±0.82,-37.74±0.89 mV,其斜率因子分别为6.93±0.46 mV,6.55±0.72mV,6.86±0.78 mV,三组间半失活电压和斜率检验未见显著差异。5.对照组、7天组和模型组VGSCs的恢复时间常数为3.06±0.83 ms,3.10±0.53 ms,3.17±0.49ms,三组间VGSCs的恢复未见明显差异。【结论】研究结果从MPG的膀胱神经元VGSCs功能的角度再次证实体神经可以再生替代内脏神经。人工反射弧建立后MPG的电压门控钠离子通道动力学特征的相对稳定也是反射弧能发挥作用重要保证。钠通道电流密度动态变化与人工反射弧机制和神经可塑性紧密相关。第四部分:人工体神经-内脏神经反射弧建立后盆节钠通道亚型半定量研究【目的】通过VGSCs表达量上的变化研究,为深入阐明反射弧机制奠定基础。【方法】采用半定量PCR及图像分析的方法测定盆神经节神经元钠通道各亚型在反射弧建立后不同时间段的MPG的VGSCs表达分布进行鉴定研究。【结果】对照组、7天组和模型组MPG中Nav1.1平均表达分别为0.7760±0.1030,0.4584±0.0335和0.7298±0.1156。而Nav1.6平均表达为0.7170±0.0697,0.7820±0.0663,0.7951±0.0810,Nav1.7平均表达为1.2780±0.1876,0.6168±0.09211,1318±0.1055。7天组Nav1.1和Nav1.7表达显著的下调,达到50%左右,与对照组相比,差异有显著性。模型组中则显著恢复。而Nav1.6表达无变化。【结论】人工反射弧建立过程中,MPG神经元中Nay1.1和Nav1.7,可能参与了神经再生和功能重建的可塑性改变。Nav1.1和Nav1.7两种VGSCs亚型的表达量的动态变化可能与人工体神经-内脏神经反射弧的作用机制相关。