论文部分内容阅读
目的探索Huh7、MHCC-97H肝癌细胞缺氧培养下分泌的外泌体对常氧肝癌细胞生物学行为以及索拉菲尼敏感性的影响。方法通过梯度超速离心提取Huh7、MHCC-97H肝癌细胞来源的常氧、缺氧外泌体。利用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形态学特征;纳米颗粒跟踪分析(NTA)分析外泌体的粒径大小以及浓度;western blot实验鉴定外泌体表面标记物的表达。分别将常氧外泌体、缺氧外泌体与肝癌细胞在常氧条件下共培养后,采用CCK8实验、细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。采用CCK8实验检测Huh7、MHCC-97H肝癌细胞对索拉菲尼(sorafenib)的半数抑制浓度(IC50)。采用western blot实验检测与外泌体共培养后Huh7、MHCC-97H肝癌细胞EMT标志蛋白——钙粘蛋白E(E-cadherin)、钙粘蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达情况。利用miRNA测序,探究Huh7肝癌细胞来源的常氧外泌体及缺氧外泌体之间差异表达的miRNA。结果Huh7、MHCC-97H肝癌细胞来源的常氧外泌体、缺氧外泌体在透射电镜下呈现圆形或椭圆形的囊泡结构,大小在30~150nm之间,在外泌体蛋白裂解液中检测到外泌体表面标志物CD63和CD81的存在。纳米颗粒跟踪分析显示,Huh7细胞来源的常氧外泌体和缺氧外泌体的粒径无明显差异,但缺氧能刺激Huh7细胞分泌更多的外泌体。与对照组相比(PBS组和常氧外泌体组),缺氧外泌体可显著增强常氧Huh7、MHCC-97H肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,降低对索拉菲尼的敏感性。与缺氧外泌体共培养后,细胞表达E-cadherin明显减少,表达N-cadherin、Vimentin明显增加。MiRNA测序提示Huh7肝癌细胞来源的缺氧外泌体与常氧外泌体之间存在151个表达差异的miRNA,并对上调的前10个差异miRNA进行了生物信息学分析。结论我们成功提取并鉴定了Huh7、MHCC-97H肝癌细胞来源的常氧、缺氧外泌体,并且发现缺氧能够刺激Huh7细胞分泌更多的外泌体。缺氧Huh7、MHCC-97H肝癌细胞分泌的外泌体可以增强常氧肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,降低对索拉菲尼的敏感性,且能诱导其发生上皮间质转化。此外,外泌体miRNA测序筛选出的差异表达的miRNA及其生物信息学结果表明,缺氧外泌体携带的miRNA可能在其中扮演了重要的角色。研究结果提示,缺氧外泌体介导的细胞间信息传递可能是缺氧微环境中肝癌细胞恶性程度增加的关键机制之一。