研究目的肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)发病率呈不断上升趋势,目前约为16.3/10万,且3年内急性恶化发生率为20.7%。PF的主要病理特点是初期广泛性肺泡炎形成,后期大量成纤维细胞增生,以及基质胶原进行性积聚,最后取代正常的肺组织结构。发病机制尚不清,病死率高,目前缺乏有效药物。本课题前期研究结果表明,加减补肺汤有抗氧化作用拮抗纤维的形成。但是加减补肺汤拮抗肺纤维化的具体分子机制目前尚不十分清楚。为阐明加减补肺汤对肺纤维化的作用及其可能的作用机制,本研究拟通过博来霉素诱导肺纤维化小鼠为模型,观察加减补肺汤对小鼠肺纤维化模型的病理形态学改变,检测加减补肺汤对小鼠肺组织中TGF-β1、TNF-α、CatD、LC3和mTOR表达的影响,研究加减补肺汤对肺纤维化小鼠的作用,初步探讨其抑制肺纤维化的机制。研究方法及结果1采用不同剂量的博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型,探讨复制小鼠肺纤维化模型的理想剂量。(1)方法:昆明种小鼠90只,随机分为空白组、假手术组、模型高(7.5mg/kg)、模型中(5mg/kg)和模型低(2.5mg/kg)剂量组,每组18只。模型组气管内单次注入博来霉素生理盐水溶液,假手术组气管内单次注入等体积生理盐水。各组动物分别于第3天、7天、14天处死,取肺组织进行HE染色,观察肺组织病理改变及死亡率。(2)结果1)博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型复制成功。2)博来霉素注入剂量与肺纤维化程度及死亡率呈正相关。3)小鼠肺纤维化模型的建立:采用经气管内一次性给药方法,用博莱霉素5mg/kg是较为理想的复制小鼠肺纤维化模型剂量。2加减补肺汤对博来霉素诱导小鼠肺纤维化形态结构的影响,探讨加减补肺汤抗小鼠肺纤维化的药效。(1)方法:昆明小鼠306只,随机分为假手术组、模型组、加减补肺汤高剂量组、加减补肺汤中剂量组、加减补肺汤低剂量组、醋酸泼尼松组和加减补肺汤中剂量+醋酸泼尼松组,假手术组36只,其余每组均为45只。除假手术组,其余各治疗组及模型组气管内均单次注入博来霉素生理盐水溶液(5mg/kg)复制小鼠肺纤维化模型,假手术组气管内单次注射等体积的生理盐水。各治疗组于造模后第二天开始给予相应的药物干预,加减补肺汤高、中、低剂量组分别按12g/kg/d、6g/kg/d、3g/kg/d剂量给药,醋酸泼尼松组按0.5mg/kg/d剂量给药,加减补肺汤中剂量+醋酸泼尼松组:上午给加减补肺汤按6g/kg/d剂量给药,下午醋酸泼尼松按0.5mg/kg/d剂量给药;模型组和假手术组分别给予等量的生理盐水灌胃。各组动物于第7天、14天、28天随机取10只处死,取肺组织进行he染色,观察肺组织病理改变,对图片进行定量分析。(2)结果:he染色显示,假手术组:肺泡结构完整、清晰,未见炎症细胞浸润和肺实质病变;模型组:肺泡间隔增宽变形,肺泡结构紊乱,早期肺泡腔内重度炎性细胞浸润,晚期成纤维细胞大量增生,纤维组织呈条索样改变,纤维化程度随时间的进展而加深加重;加减补肺汤高、中、低剂量组、醋酸泼尼松组和加减补肺汤中剂量+醋酸泼尼松组:肺泡结构较为清晰,在支气管周围有局部纤维化,肺泡间隔增厚,较模型组有所减轻。3加减补肺汤干预小鼠肺纤维化作用机制研究(1)方法:171只昆明小鼠,随机分为假手术组、模型组、加减补肺汤组和醋酸泼尼松组,假手术组36,其余各组均为45只。模型组、加减补肺汤组和醋酸泼尼松组,气管内注射博来霉素(5mg/kg)诱导肺纤维化;假手术组在相同条件下给予生理盐水。造模后第二天开始给药,加减补肺汤组按12g/kg/d剂量给药,醋酸泼尼松组按0.5mg/kg/d剂量给药;模型组和假手术组分别给等体剂生理盐水灌胃。各组动物于第7、14、28天随机取10只处死,取肺组织he染色,观察肺组织病理改变。用免疫组化和westernblot方法,对于各组小鼠肺组织中tgf-β1、tnf-α、catd、lc3和mtor表达量进行观察,并用图像分析软件分析各组的平均光密度。(2)结果:1)tnf-α和tgf-β1免疫组化结果表明,tnf-α和tgf-β1在假手术组表达较弱;在模型组表达随时间延长逐渐增强,与假手术组比较有显著差异(p<0.01);加减补肺汤及醋酸泼尼松组在各时间点表达趋势与模型组相同,但与模型组比较均有显著差异(p<0.01或p<0.05);到第28d时,加减补肺汤组优于强的松组,但两组无明显差异(p>0.05)。第14d各组小鼠肺组织中tgf-β1和tnf-α的westernblot实验结果与免疫组化结果相一致。2)catd免疫组化结果表明,假手术组在支气管上皮细胞有少量catd表达;博来霉素诱导肺纤维化小鼠catd表达明显增多,在肺间质和支气管上皮细胞中都有表达,并且随时间延长有增多的趋势,第7天、14天和28天时与假手术组比较都有明显差异(p<0.01);强的松、加减补肺汤组:catd表达趋势与模型组相同,但表达较模型组明显减少,与模型组比较均有显著差异(p<0.01或p<0.05)。3)通过对肺组织中lc3表达情况的分析,我们发现lc3存在于正常肺组织的支气管及血管周围,且蛋白表达较弱,说明在正常组织细胞内自噬功能较低;而在肺纤维化肺组织中,lc3除了见于支气管及血管周围以外,尚可见lc3在细胞浆中有阳性表达,与假手术组比较,博莱霉素处理后各时间点小鼠肺组织中lc3的表达均显著升高(p<0.01);加减补肺汤组lc3表达较模型组明显降低,说明加减补肺汤能减少肺纤维化小鼠肺组织中lc3的过度表达。4)mtor免疫组化结果表明,假手术组:mtor蛋白表达在支气管、血管周围,胞浆中有少许阳性表达。模型组:mtor表达明显增多,胞浆中也有阳性表达。第7天、14天和28天时与假手术组比较都有显著性差异(p<0.01),提示模型组随着肺纤维化程度加重mtor被激活。加减补肺汤组:表达趋势与模型组相同,但表达较模型组明显减少(p<0.05),提示加减补肺汤能使肺纤维化小鼠肺组织中mTOR活性下降结论1用5mg/kg博莱霉素是较为理想的复制小鼠肺纤维化模型剂量。2加减补肺汤能改善肺纤维化小鼠炎性细胞浸润,明显减轻肺纤维化程度,从而干预肺纤维化的形成。3加减补肺汤干预小鼠肺纤维化作用机制研究(1)加减补肺汤能抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化肺组织TNF-α、TGF-β1蛋白的表达,明显减轻肺纤维化模型小鼠肺泡炎的发展及肺纤维化的形成。(2)加减补肺汤能减轻博莱霉素诱发的小鼠肺纤维化,其作用机制可能与抑制Cathepsin D的过度表达有关。(3)加减补肺汤能减少肺纤维化小鼠肺组织中LC3、mTOR的过度表达,干预肺纤维化的形成。