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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseases, AD)是一种系统变性疾病,主要发病机制之一是β-淀粉样蛋白(Amyloid beta protein, Aβ)的沉积,其中Ap等导致的炎症反应是促进AD病理生理进展的重要组成部分。有研究显示重度AD外周血中具有免疫抑制功能的调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)降低,淋巴细胞存在着免疫反应异常和过度的炎性反应。另有研究表明血液中促炎因子IL-1是AD重要的危险因子,抗炎因子IL-4、IL-10能减轻Ap引起的炎症反应,而AD外周血中IL-1上升,IL-4和IL-10浓度下降。因此免疫调节可能对AD有治疗效果。具有免疫调节功能的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)有明显的伦理、安全的限制,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)有技术和来源等方面的限制。而具有良好免疫调节作用的脐血多能干细胞(cord blood-stem cells, CB-SCs)则来源广、易于提取与培养,并且没有伦理学和安全等方面的限制。本实验就应用CB-SCs与阿尔茨海默病患者外周血淋巴细胞在体外条件下进行共培养,初步探讨其治疗AD的潜能。研究方法1.脐血多能干细胞的制备采集健康孕产妇婴儿的脐带血,Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,红细胞裂解液除去其中的红细胞。分离出的单个核细胞,种植于X-VIV015无血清培养基培养。2.流式细胞鉴定CB-SCs倒置显微镜下观脐血多能干细胞的形态。0.25%胰酶-EDTA消化液消化贴壁的干细胞,用含10%FBS的X-VIV015终止消化,PBS洗3遍后用荧光抗体标记CD34和CD45,流式细胞检测细胞表面标志物CD34和CD45的表达。3.AD患者外周血淋巴细胞的制备并与共培养取用肝素钠抗凝的AD患者空腹静脉血约10 mL,同样方法分离的AD病人外周单个核细胞接种于含20% FBS的RPMI 1640的培养基,在37℃、5% CO2全湿条件下孵育24 h,收集悬浮的淋巴细胞。脐血多能干细胞CB-SCs和AD病人外周血淋巴细胞以1：3的比例共培养作为实验组,单独培养的淋巴细胞组作为对照组,并且共培养组和实验组分别设置淋巴细胞刺激剂刺激的共培养组和淋巴细胞刺激剂刺激的对照组,加入的淋巴细胞刺激剂PHA-P的浓度为4 mg/L。X-VIVO15无血清培养基培养3天。4.计数细胞悬液中的淋巴细胞分别收集各培养组细胞悬液并离心,计数得到的淋巴细胞。5.酶联免疫吸附检测采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测上清液中抗炎因子和促炎因子的浓度。IL-1、IL-4和IL-10的浓度测定根据Blue Gene公司试剂盒提供的说明书进行操作。6.流式细胞检测收集各组悬液中的淋巴细胞做流式细胞检测。荧光抗体标记CD4和CD8分子,检测各组CD4+/CD8+T淋巴细胞比例。依据eBioscience公司提供的人调节性T细胞染色试剂盒说明书对调节性T细胞进行染色：荧光抗体标记细胞表面分子CD4和CD25和细胞内因子Foxp3、IL-10和TGF-β1,检测Treg细胞的比例及细胞内功能蛋白IL-10和TGF-β1。研究结果1. CB-SCs的形态学特点及标志物表达原代CB-SCs呈现贴壁生长,呈圆形或椭圆形。特异性标志物CD45表达率达100%,阴性标志物CD34阴性率为2.5%。2. CB-SCs抑制PHA-P导致的淋巴细胞增值在淋巴细胞刺激剂PHA-P存在的情况下,CB-SCs可使与之共培养的淋巴细胞数量明显下降,并且CB-SCs可以对抗PHA-P诱导的淋巴细胞聚集反应。3. CB-SCs调节上清液中细胞因子CB-SCs显著下调共培养组上清液中的促炎因子IL-1,明显上调共培养组上清液中抗炎因子IL-4和IL-10。4. CB-SCs对淋巴细胞中T淋巴细胞亚群的调节作用通过流式细胞术实验数据分析,CB-SCs可以明显降低淋巴细胞中CD4+/CD8+T淋巴细胞的比例。CB-SCs明显提高CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例和CD4+CD25+T细胞中Foxp3+的阳性率。并且在淋巴细胞刺激剂PHA-P的刺激下,CB-SCs上调CD4+CD25+T细胞中Foxp3、IL-10和TGF-β的阳性率,增强Treg细胞的抑制功能。另外,CB-SCs可使CD4+CD25+Foxp3-细胞的比例下降,降低激活态CD4+T细胞的比例。结论1. CB-SCs呈圆形或椭圆形,贴壁生长；高表达CD45,低表达CD34。2. CB-SCs可以负向调节与之共培养的AD外周血淋巴细胞的免疫反应,并减轻其炎症反应。3. CB-SCs调节淋巴细胞亚群的比例,能上调调节性T细胞的比例并增强其免疫抑制功能。