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糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动，糖苷酶是一类水解糖基辍合物糖苷键的水解酶，糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。糖基化修饰代谢异常与很多疾病密切相关，如家族黑蒙性白痴、山德霍夫氏病、Ⅱ型糖尿病、阿尔茨海默病和肿瘤等。人己糖胺酶D（HexD）是新发现的一种糖苷水解酶，但该酶的酶学特性、底物特异性及催化机制尚不清楚。本实验首先将HexD的cDNA序列构建到质粒pET3C中，重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）plysS后，利用Ni-NTA亲和层析技术纯化出该酶，测定该酶最适pH、热稳定性和金属离子对该酶活性的影响。同时，利用生物信息分析同家族酶蛋白序列，找到两个可能的关键催化氨基酸，分别是148位的Asp和149位的Glu，通过氨基酸突变分析确定两者的催化作用。然后，通过HexD对多种底物如荧光底物、糖肽和糖脂的水解作用，与另外两种己糖胺酶HexA/HexB和OGA作对比，分析三种己糖胺酶底物特异性的异同点。最后，利用表达纯化出的HexD蛋白，制备HexD多克隆抗体。具体结果如下。成功构建了pET3C/HexD重组质粒，表达了大量的可溶性HexD蛋白。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖（4-MU-O-GalNAc）为荧光底物，测定该酶的最适反应pH值为5.5，最适反应温度为37℃，且该酶的热稳定性较好，在50℃下放置半小时仍有较高活性。研究金属离子对该酶的影响发现，1mM的金属离子（CuSO4、FeSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、NiSO4·6H2O、AlCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2）对该酶活性影响不大，不过10mMAlCl3、 CuSO4、FeSO4·7H2O对该酶有不同程度的抑制，其中Al3+抑制作用最强。通过对HexD序列中148位的天冬氨酸和149位的谷氨酸定点突变，我们发现将148位Asp突变为Glu和Asn之后，酶的活性彻底失去，而将149位的Glu突变为Asp和Gln之后，未发现酶活性的明显降低，表明HexD序列中Asp148为亲核氨基酸，Glu149为酸碱催化氨基酸。利用4-MU荧光基团连接的多种糖基化底物和糖肽水解实验，我们发现HexD偏好于水解O-β-GalNAc底物，为了探讨其在生命体中的底物，我们合成了β-GalNAc连接的糖脂，遗憾的是通过质谱、TLC方法未检测到HexD对该糖脂的水解活性。另外，利用大肠杆菌表达纯化出的HexD蛋白制备特异性多克隆抗体，Western blotting检测表明，该抗体特异性较高。溶酶体中存在的己糖胺酶：HexA/HexB既能水解O-β-GalNAc结构的底物也能水解O-β-GlcNAc结构的底物；核质中存在的另一种己糖胺酶：OGA仅仅能水解O-β-GlcNAc结构的底物。