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蚊可以传播疟疾、登革热、黄热病等多种蚊媒病,严重危害人类健康。控制蚊媒对于预防蚊媒病具有重要意义。化学防制因具有起效快、作用强、使用方便等优点,一直作为蚊媒控制策略中的主要方法。但随之产生的抗药性成为蚊媒病控制的最大障碍。如何采取科学合理的抗药性治理措施以减少或避免蚊抗药性的发生与发展,是研究者所面临亟待解决的问题。深入了解蚊抗药性产生机制,可为抗药性治理提供科学的理论依据。早期发现并实时监测蚊现场种群对不同杀虫剂的抗性水平,是抗药性治理的前提。随着现代生物技术发展,尤其在蛋白质组学方面,一系列新技术和方法相继出现并日趋成熟,使得有可能采用蛋白质组学方法,筛选蚊抗药性相关蛋白,有利于进一步探讨抗药性机制,并有望发现一些靶蛋白应用于蚊抗药性现场检测。本研究以淡色库蚊(Culex pipiens pallens)实验室溴氰菊酯敏感品系(Lab-DS)和抗性品系(Lab-DR)为材料。通过相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)联合液相色谱-串联质谱的方法(liquid chromatography/tandem mass spectrometric,LC-MS/MS),比较了两种品系4个不同发育阶段(四龄幼虫、蛹、雄蚊和雌蚊)的表达蛋白。本研究进行了2次生物学重复,结果筛选出30个共有的差异蛋白,其中15个差异蛋白在Lab-DR品系中高表达,15个差异蛋白在Lab-DR品系中低表达。经GO分析和 pathway分析,发现这些差异蛋白主要参与代谢(包括糖代谢)、氧化磷酸化、表皮构成等生理过程。根据差异蛋白的生物学功能,基于雌蚊的医学重要性,我们首先采用实时定量PCR方法验证了5个候选蛋白CYP6AA9、 ATP synthase B chain、prag01、CPIJ009715 和 anamorsin在Lab-DS品系和Lab-DR品系雌蚊中的表达情况。结果显示：(1) CYP6AA9、ATP synthase B chain、prag01在Lab-DR品系中高表达(P<0.05);(2) anamorsin在Lab-DR品系中低表达,但差异不具有统计学意义(P>0.05); (3) CPIJ009715在Lab-DR品系中低表达(P<0.001)。根据实时定量PCR结果,我们选择3个候选蛋白CYP6AA9、pragOl和CPIJ009715进行蛋白质水平上的验证。针对CYP6AA9和pragOl的氨基酸序列,我们分别设计并合成了各2个肽段；同时,对CPIJ009715部分蛋白序列进行了重组表达。以纯化后的肽段和重组蛋白作为抗原,成功制备了CYP6AA9、pragOl和C PIJ009715的多克隆抗体。通过Western blot方法比较3个差异蛋白在Lab-DS品系和Lab-DR品系4个不同发育阶段中的表达。结果显示：(1)Lab-DR品系4个不同发育阶段中的CYP6AA9表达量均高于Lab-DS品系,尤其在雄蚊和雌蚊阶段的表达差异最为明显；(2)Lab-DR品系雄蚊中的CPIJ009715表达量高于Lab-DS品系,在两种品系四龄幼虫中CPIJ009715表达量无明显差异,而在两种品系蛹和雌蚊中均未见表达；(3)两种品系4个不同发育阶段中pragOl均未见表达。基于实验室种群Western blot结果,提示CYP6AA9与拟除虫菊酯抗性密切相关,有望作为靶蛋白应用于蚊抗药性现场检测。随后,我们从安徽省蚌埠市、山东省济宁市和江苏省南京市采集了3个淡色库蚊现场种群,以进一步验证CYP6AA9在现场种群中的表达。参照世界卫生组织(World Health Organization, WHO)成蚊接触筒法,本研究对3个现场种群进行了生物测定,以0.05%溴氰菊酯接触1 h时击倒的蚊作为敏感品系,未被击倒的蚊作为抗性品系。通过Western blot方法比较了CYP6AA9在3个现场种群敏感品系和抗性品系中的表达。结果显示CYP6AA9在3个现场种群抗性品系中均高表达,与实验室种群的验证结果一致,进一步证实CYP6AA9与蚊拟除虫菊酯抗性密切相关。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)由于操作简单,敏感性高,且可用于定量分析,被广泛应用于各种抗原和抗体的测定。本研究采用ELISA方法比较CYP6AA9在实验室和现场不同抗性品系中的表达情况。结果显示：(1)CYP6AA9表达量与蚊抗药性水平呈正相关；(2)CYP6AA9在实验室敏感品系、低抗性品系和现场抗性品系中的表达量差别不明显,提示在低抗性水平时,CYP6AA9表达量可能较低,难以有效区分敏感品系和低抗性品系；(3)实验室高抗性品系中CYP6AA9表达量明显高于实验室敏感性品系、低抗性品系和现场抗性品系,且济宁抗性品系中的CYP6AA9表达量稍高于蚌埠抗性品系,与现场生物测定结果一致。结合上述结果提示：CYP6AA9可作为拟除虫菊酯抗性检测的靶抗原,通过ELISA方法可比较不同现场种群的抗性水平,尤其适用于高抗性水平的现场种群。本研究首次报告了淡色库蚊抗药性比较蛋白质组学,通过iTRAQ联合LC-MS/MS方法筛选出30个蚊抗药性相关蛋白,通过实时定量PCR和Westernblot方法,对候选蛋白在淡色库蚊实验室种群和现场种群分别进行了验证。结果发现,CYP6AA9与蚊拟除虫菊酯抗性密切相关。我们初步建立了一种基于CYP6AA9的蚊抗药性ELISA检测方法,有望应用于比较不同现场种群的抗性水平。