产β-葡萄糖苷酶细菌菌株的筛选、酶的分离纯化及酶学性质的研究

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本论文是基于β-葡萄糖苷酶在天然色素生产方面的作用而进行的研究。该酶能够水解栀子苷产生京尼平,京尼平与谷氨酸钠等含氨基的化合物反应生成色泽稳定、无毒无害的天然蓝色素。同时,京尼平本身也是一种天然的交联剂,可以用于制作人造骨骼、伤口包扎材料,还能够促进胰岛素的分泌,缓解Ⅱ型糖尿病的症状。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要组分之一,在植物纤维的降解中不可或缺,它在食品、饮料、医药等领域有重要的应用价值。例如,它能用来生产龙胆低聚糖、甜菊糖等低能量、高甜度、易代谢的天然甜味剂;能够水解茶、葡萄酒和其他饮料中的糖苷类前体物质,从而增加饮料的风味物质;可以水解大豆异黄酮,增加其在人体中的吸收率,从而有效降低心血管和骨质疏松等疾病的发病率。   本研究共筛选了7份土壤样品,初筛得到18株能代谢β-葡萄糖苷酶水解栀子苷的菌株。以pNPG为检测底物进行复筛,选取了一株活性最佳的菌株--6C进行后续实验。经过16S rRNA分析,结合形态学及生理生化特征的研究,该菌株被鉴定为Bacillus Korlansys6C菌株于37℃,180 rpm摇瓶发酵24 h,得到7.5 L发酵液。运用中空纤维素膜超滤,疏水层析、阴离子交换层析及凝胶层析等色谱技术进行分离纯化。经疏水层析,发现6C菌株能代谢两种β-葡萄糖苷酶,分别记为酶A、酶B。纯化结束后,酶A的纯化倍数为483.65,回收率为7.24%;酶B的纯化倍数为316.74,回收率为0.21%。经Native-PAGE和SDS-PAGE电泳检测,确定酶A分子量约为80 kD,酶B分子量约为90 kD,均由单个亚基组成。   对来源于6C菌株的酶A进行酶学性质研究,发现最适反应pH为7.0,最适反应温度为40℃;在pH5-9的范围内,低于50℃的条件下具有很好的稳定性,超过60℃酶活力迅速降低;酶A的底物专一性不高,能水解多种含β-糖苷键的底物,但对α-糖苷键不表现水解作用,其中,该酶的最适底物为oNPG,测定Km为0.73,对pNPG的水解能力也很强,Km值为2.71。分析9种金属离子对酶A活性的影响,结果显示Ca2+、Pb2+能够激活该酶的活性,Cu2+、Fe2+则抑制该酶活性,其他离子对酶活的影响不大。  
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