论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病,以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现,其病理学特征是中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元脱失,残存的神经元内出现路易小体(Lewy bodies,LBs)。而alpha-突触核蛋白是LBs的主要成分,其基因错义突变(A53T,A30P,E46K)能够导致家族性PD。研究已经证实alpha-突触核蛋白的异常聚集是PD发病机制中的关键因素,因此研究降低alpha-突触核蛋白的分子或药物成为治疗PD的重要策略。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一种水溶性的多酚羟基化合物,广泛分布于植物中,由一分子咖啡酸和一分子3,4-二羟基苯基乳酸(即丹参素)缩合而成。迷迭香酸是天然的抗氧化剂,具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫抑制等多种生物活性。本实验室的前期研究工作表明,迷迭香酸对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的PD大鼠SN的DA能神经元具有保护作用,其机制可能与抗氧化、降低SN铁水平有关。在离体实验中,迷迭香酸也可以通过抗氧化作用拮抗神经毒素1-甲基-4苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridium,MPP+)和6-OHDA导致的DA能神经元的损伤。但其确切的神经保护作用的分子机制仍不清楚。由于alpha-突触核蛋白在PD发病机制中的重要作用,其错义突变和异常聚集能够导致DA能神经元的退行性改变,而氧化应激能够导致alpha-突触核蛋白的异常聚集,提示迷迭香酸可能通过其抗氧化作用抑制alpha-突触核蛋白的异常聚集。研究也证实迷迭香酸在体外可以抑制alpha-突触核蛋白纤维的生成,但是迷迭香酸在PD中的保护作用是否与抑制alpha-突触核蛋白的聚集有关及可能的机制尚不清楚。鱼藤酮是一种常用的除草剂和杀虫剂,能够通过血脑屏障,通过抑制线粒体呼吸链复合物I的活性,从而导致SN DA能神经元的能量合成障碍,进而引起神经元的死亡。因此,鱼藤酮被用于PD模型的制备。与其他的PD动物模型相比,鱼藤酮制备的PD模型具有明显的优势,它能够模拟PD的病理性特征变化,包括SN DA能神经元数目的降低和残存神经元内的alpha-突触核蛋白的聚集。因此,本实验选用鱼藤酮制备的PD模型,应用免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blots、流式细胞术等技术,研究了迷迭香酸对鱼藤酮诱导的alpha-突触核蛋白聚集的作用,并深入探讨其可能的分子机制。实验结果如下:1.鱼藤酮处理C57BL/6小鼠56天后,小鼠在旋转棒上的停留时间缩短46%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05);20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸预保护组小鼠在旋转棒上的停留时间分别增加83%和79%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。2.鱼藤酮处理C57BL/6小鼠56天后,小鼠SN DA能神经元数目减少42%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001);SN区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达降低28%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸预保护组小鼠SN DA能神经元数目与鱼藤酮组相比分别增加28%和41%,SN区TH表达与鱼藤酮处理组相比分别增加15%和30%,差别有统计学意义(P<0.05)。3.鱼藤酮处理C57BL/6小鼠56天后,小鼠SN区alpha-突触核蛋白的表达增加37%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001);20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸预保护组小鼠SN区alpha-突触核蛋白的表达分别降低19%和22%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。4.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞存活率降低33%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001);而10-5~10-10 mol/L迷迭香酸预处理组细胞存活率分别增加18%、21%、14%、10%、18%和14%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。5.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞线粒体跨膜电位差(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)降低10%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001);细胞内B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷酸化Bcl-x1/Bcl-2相关死亡启动子(Bcl-xl/Bcl-2-associated death promoter,Bad)的表达分别降低56%和40%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞ΔΨm分别升高8%和6%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.001);细胞内Bcl-2的表达分别增加61%和76%,p-Bad的表达分别增加46%和51%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。6.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞内alpha-突触核蛋白m RNA的表达增加3.44倍,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞alpha-突触核蛋白m RNA表达分别降低66%和52%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。鱼藤酮组细胞内alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多。而10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理可以拮抗鱼藤酮诱导的alpha-突触核蛋白的聚集。7.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞内活性氧物质(reactive oxide species,ROS)的生成增加139%,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的表达降低42%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001)。10-9、10-5mol/L迷迭香酸预处理组细胞ROS的生成分别减少57%和75%,与鱼藤酮组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001);细胞内SOD的表达分别增加35%和32%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。8.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞内血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的表达降低50%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞内HO-1表达分别增加52%和37%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。9.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞核内的核转录因子NF2E2相关因子2(NF2E2-related factor 2,Nrf2)的表达增加71%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞核内Nrf2的表达分别增加25%和40%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。10.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞内缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、缺氧诱导因子2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的表达分别降低76%和37%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.01);10-9 mol/L迷迭香酸预处理组细胞内的HIF-1α、HIF-2α的表达分别增加39%和43%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。11.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞内热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的表达降低44%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞内HSP70的表达分别降低33%和33%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。12.500 nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24 h后,细胞外信号调节酶(extracellular signal regulated kinases,ERKs)的磷酸化水平降低77%,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸预处理组细胞内ERK1/2的磷酸化水平分别增加75%和100%,与鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.01)。MEK特异性抑制剂PD98059(10μM)预处理0.5 h后与迷迭香酸以及鱼藤酮共同孵育24 h,可以完全阻断迷迭香酸诱导的HO-1、HSP70的上调,细胞内HO-1、HSP70的表达分别减少30%和25%,与10-9 M迷迭香酸/鱼藤酮组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明:迷迭香酸能够保护鱼藤酮诱导的PD小鼠模型,其保护作用的机制可能与其降低鱼藤酮诱导的PD小鼠SN的alpha-突触核蛋白的表达有关;体外实验的机制研究证实迷迭香酸可以通过保护线粒体功能,上调Bcl-2以及p-Bad的表达,从而拮抗鱼藤酮引起的细胞凋亡。迷迭香酸可能通过其抗氧化作用降低鱼藤酮诱导的alpha-突触核蛋白的表达,并通过MEK/ERK通路上调HO-1及HSP70的表达,抑制alpha-突触核蛋白的异常聚集,促进异常alpha-突触核蛋白的降解,从而降低alpha-突触核蛋白的蛋白水平,并证实其上调HO-1的机制可能与上调Nrf2以及HIF-1α的表达有关。以上结果提示迷迭香酸可能通过抑制α-突触核蛋白的表达并增强其蛋白降解,从而降低鱼藤酮诱导的alpha-突触核蛋白的蛋白水平,并抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡而发挥其在PD中的神经保护作用。本实验所研究的迷迭香酸对DA能神经元的保护作用及其可能机制的初步探讨,为PD的防治提供全新的研究结果和药物防治的新策略。