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脂滴包被蛋白(perilipin,PLIN1)是一种在真核生物中由PLIN1基因编码的蛋白质。PAT家族是与脂滴表面蛋白相关的蛋白质家族。PLIN1的磷酸化对脂肪组织中脂肪代谢有重要作用,在脂肪细胞中调节脂肪分解和脂肪储存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外层,可阻止体内脂肪酶进入脂滴,如激素敏感性脂肪酶(HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)。PLIN1基因对脂肪分解具有双向调控作用:基础状态下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯,从而抑制脂肪分解;能量需求增加时,c AMP-PKA信号通路被激活,PLIN1磷酸化促进脂解。为了探究牛PLIN1基因对牛脂肪细胞增殖分化和脂类代谢的调控作用,本研究以秦川肉牛初生犊牛前体脂肪细胞为实验材料,通过腺病毒介导过表达和干扰PLIN1基因的方法,来探讨PLIN1基因在调控牛前体脂肪细胞增殖分化过程及脂类代谢中作用,主要研究内容如下:1、PLIN1基因多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析检测PLIN1基因在秦川肉牛12个不同组织部位中的表达量,牛PLIN1基因在皮下脂肪组织中表达量显著高于其它组织(p<0.01)。在510头秦川肉牛样本中,通过直接测序检测到PLIN1基因上存在5个SNP位点,分别是g.3579T>C、g.3897G>A、g.8332G>A、g.10516T>C和g.10537G>T。关联分析显示,这5个SNP位点与秦川肉牛部分生长发育性状和肉质性状紧密关联。单倍型组合型H2H4可作为有效分子标记用于秦川肉牛育种。2、转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用克隆得到PLIN1基因5’端上游序列1978bp,通过逐段缺失及双荧光素酶活检测确定PLIN1基因核心启动子区位于-209～-17bp之间。在核心启动子区域预测并筛选得到C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等重要转录因子。通过定点突变和干扰试验,C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子在维持PLIN1基因启动子活性中起到重要作用。进一步通过EMSA实验,在体外验证C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子是PLIN1基因的关键转录因子,验证了PLIN1基因在牛脂肪细胞中有重要调控作用。3、PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用通过构建牛PLIN1基因腺病毒过表达和干扰载体,并包装获得过表达重组腺病毒Ad-PLIN1和干扰重组腺病毒sh-PLIN1。在牛前体脂肪细胞中,过表达PLIN1基因在m RNA水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4、DGAT2和C/EBPβ等基因的表达,抑制了PLIN2和ATGL等脂肪代谢基因的表达,在蛋白水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4和DGAT2等基因的表达,抑制了ATGL基因的表达;类似地在牛前体脂肪细胞中干扰PLIN1基因则会有相反的结果。在过表达PLIN1基因后,油红O染色结果显示脂肪细胞中脂滴数目增加且体积增大,甘油三酯检测含量也增加;干扰PLIN1基因后,脂肪细胞中脂滴的数目减少且体积变小,甘油三酯含量减少,说明PLIN1基因能够促进牛前体脂肪细胞甘油三酯积累,在脂肪代谢中有重要调节作用。4、基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘通过转录组测序(RNA-seq)对过表达腺病毒Ad-PLIN1和Ad-NC(空载病毒)处理后的牛前体脂肪细胞差异表达基因进行分析。通过转录组测序分析,共检测到1923个差异表达基因,对差异基因GO分析和KEGG信号通路分析,部分差异基因富集在与脂肪增殖分化相关的AMPK信号通路、Wnt信号通路和PPAR信号通路上,在转录水平说明PLIN1基因对脂肪增殖和代谢有重要调节作用。测序结果也筛选了新的与脂肪代谢相关通路的差异基因,为秦川肉牛的分子育种提供理论支持。5、基于小RNA测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘进一步研究PLIN1基因对脂类代谢的影响,对转录组测序个体进行small RNA测序。对测序结果分析,共鉴定到719个已知mi RNAs和112个新的mi RNAs,发现34个差异表达mi RNA,其中18个mi RNA上调,16个mi RNA下调,对差异表达mi RNA靶基因进行预测共得到6000个靶基因。对差异表达mi RNA靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,其中部分富集在MAPK信号通路、c GMP-PKG信号通路和m TOR信号通路等脂肪代谢、蛋白质代谢和细胞免疫信号通路。通过m RNA-seq与small RNA-seq整合分析,依据mi RNA与其靶基因间的对应关系对差异表达mi RNA的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析,主要富集在Wnt信号通路、氨基酸的生物合成、p53信号通路和MAPK信号通路。综上所述,本研究通过构建逐段缺失载体和EMSA实验对牛PLIN1基因的转录调控机制初步研究,运用高通量测序RNA-seq和small RNA-seq运用多组学分析从m RNA-mi RNA水平研究PLIN1基因在脂类代谢中的作用。