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肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)是脱离血流后迁移至肿瘤组织的白细胞,主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。TIL对黑素瘤的过继治疗取得了很好的效果,而对肝癌的疗效并不理想,这可能与肝癌内TIL相对少见以及调节性T细胞的免疫抑制有关。TIL的分离和扩增方法以及快速扩增(rapid expansion procedure, REP)所需的大量IL-2和饲养细胞限制了这种过继治疗在世界范围内的推广IL-15具有刺激T细胞增殖,调节B细胞增殖和分化,提高NK细胞的杀伤活性并维持其存活,诱导细胞毒性T细胞的产生和杀伤活性,抑制活化T细胞的凋亡等功能。另外,IL-15可通过活化磷脂酰肌醇-3-激酶途径使淋巴细胞能抵抗调节性T细胞的抑制作用。本研究利用携带IL-15基因的嵌合型腺病毒-腺相关病毒杂合载体Ad5/35.AAV-hIL-15转染TIL表达IL-15。5/35嵌合型腺病毒可以有效转染T细胞和NK细胞,AAV反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)的引入可以使目的基因在细胞内持续稳定表达,突变胸苷激酶(thymidine kinase, TK)基因的表达可以使细胞在加入丙氧鸟苷(gancyclovir,GCV)后发挥自杀功能。本研究用组织块培养获得了“年轻”TIL,并对TIL REP中抗CD3单克隆抗体(OKT3)、IL-2及饲养细胞的用量进行了试验性摸索,发现OKT3用量增加并不会显著提高TIL的扩增倍数,而采用3000IU/ml IL-2或50倍于TIL的饲养细胞的扩增倍数分别与6000IU/ml和200倍的相当。最终,选择30ng/ml OKT3、3000IU/ml IL-2和50倍的饲养细胞进行TILREP,扩增达4000倍以上。若用于REP的TIL细胞数不少于5×107,那么理论上扩增后TIL可达到2×1011以上对含IL-15基因的质粒进行PCR,得到的目的基因产物与质粒pDC759-TV1经EcoRI和BamHI酶切后连接,成功构建了质粒pDC759-hlL-15。质粒鉴定正确后与含35型腺病毒纤毛的腺病毒骨架质粒共转染293细胞,同源重组产生杂合病毒Ad5/35.AAV-hIL-15。该病毒充分结合了腺病毒和AAV的优势,能有效转染T细胞并稳定表达IL-15。采用CopGFP报告基因证实了载体Ad5/35.AAV对TIL的转染效率明显高于Ad5.AAV。ELISA检测到病毒Ad5/35.AAV-hlL-15转染的TIL有目的蛋白IL-15的表达。MOI=1、10时病毒Ad5/35.AAV-hIL-15可促进TIL增殖,MOI=100时则对增殖不利。加入GCV后,观察病毒Ad5/35.AAV-TK-CopGFP转染的SMMC-7721的绿色荧光及细胞形态,MTT法检测病毒转染后TIL的增殖情况,最终确认了病毒转染后突变TK的表达及其自杀功能。MOI=1、10时病毒Ad5/35.AAV-hIL-15转染的TIL对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性显著增强。目前已完成大部分体外实验研究,还需用大规模REP检验初步优化的扩增条件。用流式细胞术检测TIL表型,弄清REP及病毒转染对TIL的影响。从肝癌组织建立原代细胞系,用对应的TIL在病毒转染后进行体外及小鼠荷瘤模型的杀伤实验。这些都是接下来要进行的工作。