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【研究背景】肾结石是在我国泌尿外科是一种常见病及多发病,最近一项覆盖全国的大规模的横断面流行病学研究表明中国成年人肾结石患病率为5.8%,结合我国中国巨大的人口基数,目前中国约有6120万成年人罹患肾结石。该研究同时也表明在我国结石主要集中在华南及西南地区,这与南方的平均气温比北方高有关。肾结石同时也是全球性疾病,国外多项研究表明在约有5-15%的居民会罹患肾结石。在所有肾结石患者中,大约80%肾结石成分为含钙结石,其中草酸钙结石是最常见的肾结石类型,所占比例约为70%-80%。随着最近几年腔内微创技术在泌尿系结石治疗方面取得巨大成功,肾结石患者也因此受益匪浅,但是草酸钙结石的发病因素包括遗传、环境、饮食、疾病和代谢等多个方面,其确切病因仍不清楚并且缺乏有效的预防措施,其在治疗后复发率仍然很高,大多数患者一生中因为肾结石复发需要接受多次治疗,严重影响患者及其家庭的生活质量,同时也给个人及社会都带来巨大的经济负担。因此,进一步揭示草酸钙结石的确切发病机制,寻找新的有效干预靶点,具有重要的科研和临床价值。【研究目的】研究自噬对大鼠肾脏草酸钙晶体形成的影响及可能的作用机制【研究方法】取健康雄性SD大鼠40只,体重约为200±6.3g,随机分为四组,每组10只,分别为对照组、造模组、氯喹干预组、雷帕霉素干预组。大鼠肾结石模型建立方法:自由饮用1%乙二醇28天+1%氯化铵灌胃(2ml/天/只)6天。氯喹干预组采用氯喹溶液(40mg/kg/day)腹腔注射,雷帕霉素干预组采用雷帕霉素溶液(0.5mg/kg/day)腹腔注射。连续饲养28天后,收集大鼠24小时尿液并分析其成石危险相关成分的含量。取大鼠双侧肾脏,应用免疫组化及透射电镜方法检测各组大鼠肾脏自噬水平,并且通过透射电镜观察线粒体形态。通过免疫组化方法检测各组大鼠肾脏内氧化应激损伤相关标志物。【研究结果】1.各组大鼠尿液24小时尿危险成分分析与对照组相比,模型组大鼠尿草酸排泄量明显升高(P<0.05),而尿枸橼酸排泄量明显降低(P<0.05)。与对照组相比,氯喹干预组大鼠尿PH值及尿钾、尿氯、尿钠、尿尿酸、尿枸橼酸排泄量均明显降低(P<0.05)。与对照组相比,雷帕霉素组大鼠尿氯、尿钾、尿钠、尿磷、尿尿酸、尿枸橼酸排泄量明显降低(P<0.05)。与模型组相比,氯喹干预组大鼠尿PH值及尿钾、尿氯、尿钠、尿磷、尿草酸排泄量明显降低(P<0.05)。与模型组相比,雷帕霉素组大鼠尿PH值及尿氯、尿钾、尿钠、尿磷、尿尿酸、尿枸橼酸排泄量明显降低(P<0.05)。与氯喹干预组相比,雷帕霉素组大鼠尿尿酸排泄量明显降低(P<0.05),其余尿液指标无明显差异(P>0.05)。2.各组大鼠肾脏草酸钙晶体形成情况对照组大鼠肾脏无可见草酸钙晶体,而造模组大鼠肾小管内可见大量折光性显著的草酸钙晶体。与模型组(32.4±5.1/HP)相比,氯喹干预组(4.0±0.9/HP)大鼠肾脏草酸钙晶体显著减少(P<0.05),而雷帕霉素干预组(102.4±8.5/HP)大鼠肾脏草酸钙晶体则明显增多(P<0.05)。3.透射电镜下各组大鼠肾脏细胞自噬水平结果对照组大鼠肾脏内可见单个自噬小体,而模型组大鼠肾脏细胞内可见多量典型的圆球形单层膜自噬溶酶体,其数量比对照组明显增多。氯喹干预组大鼠肾脏细胞内可见单个典型的圆球形单层膜自噬溶酶体。雷帕霉素干预组大鼠肾脏细胞内可见多量自噬溶酶体。4.免疫组化检测各组大鼠肾脏内自噬标志物水平与对照组相比,模型组大鼠肾脏自噬标志物LC3表达明显升高,而自噬标志物P62则明显降低。与模型组相比,氯喹干预组大鼠肾脏LC3及P62的表达均明显升高。与模型组相比,雷帕霉素干预组大鼠肾脏LC3表达明显升高,而P62的表达明显降低。5.透射电镜下各组大鼠肾脏细胞内线粒体形态观察对照组大鼠肾脏细胞内可见双层膜杆状的线粒体,线粒体内、外膜均保持完整,线粒体嵴清晰。模型组大鼠肾脏细胞内线粒体出现损伤,表现为线粒体肿胀,线粒体双层膜结构模糊,线粒体嵴数目减少,排列紊乱。氯喹干预组大鼠肾脏细胞内线粒体结构清晰,与对照组大鼠肾脏细胞内线粒体形态相似。雷帕霉素干预组大鼠肾脏细胞内线粒体明显水肿,线粒体双层膜结构模糊,线粒体嵴数目减少,排列紊乱。6.免疫组化检测各组大鼠肾脏内氧化应激相关标志物的表达水平与对照组相比,模型组肾脏的超氧化物歧化酶(SOD)表达明显降低,与对照组相比,而单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)与8-羟化脱氧鸟苷(8-OHd G)的表达则明显升高。与模型组相比,氯喹干预组大鼠肾脏的SOD表达明显升高,而MCP-1与8-OHd G的表达则明显降低。与对照组相比,雷帕霉素干预组大鼠肾脏的SOD表达明显降低,而MCP-1与8-OHd G表达则明显升高。【研究结论】1.乙二醇诱导的高草酸尿可明显提高大鼠肾脏内的自噬水平。2.本研究首次证实了自噬在大鼠草酸钙晶体形成中具有重要的调控作用,降低大鼠肾脏自噬水平可明显抑制草酸钙晶体的形成。3.自噬参与草酸钙结石形成的调控机制可能是,降低自噬水平抑制了高草酸尿诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤、线粒体损伤、以及草酸的排泄量,从而抑制了草酸钙晶体的形成。