脂肪干细胞来源施万细胞在大鼠脑损伤中的应用

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背景:施万细胞(schwann cells, SCs)在周围神经系统轴突损伤修复中起着至关重要的作用。随着组织工程技术的发展,部分学者提出用施万细胞来修复中枢神经系统的损伤。但是由于施万细胞为终末细胞,其来源和增殖能力有限、体外培养较困难,故很难获得足够数量的细胞,并不能完全满足种子细胞的要求和特点。脂肪干细胞(adipose derived (Mesenchymal) stem cells, ADSCs)具有来源广,取材方便,含量较丰富,在体外较易培养增殖等优点,使得它被越来越多人重视,成为新的组织工程种子细胞来源。目的:本试验通过对SD (Sprague-Dawley)大鼠腹股沟脂肪的提取和培养,获得脂肪干细胞,并体外诱导其分化成类施万细胞。然后用脂肪干细胞来源施万细胞移植治疗运动皮层损伤大鼠偏瘫模型,并初步探讨其对脑损伤修复的机制。方法:采用酶消化法,取SD大鼠腹股沟脂肪组织,以加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的低糖α-MEM培养基,在5%C02、饱和湿度、37℃恒温培养箱培养,传代。采用第3-5代亚融合状态细胞,通过β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME),全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA),血小板衍生因子(platelet-derived growth factor, PDGF),福斯高林(forskolin, FSK),碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF),神经胶质生长因子-2(glial growth factor-2, GGF-2)等的序贯作用下,诱导细胞分化。并行免疫荧光检测施万细胞的特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP), S-100和P75。于此同时,在显微镜下损毁大鼠左侧运动皮层,制作出对侧偏瘫大鼠模型。然后将获得的分化细胞移植到偏瘫大鼠受损脑皮层局部,观察试验大鼠的运动功能恢复情况并分别采用Longa评分和Faden评价运动功能恢复程度。进一步,我们对部分大鼠海马区组织进行nestin染色,了解移植后内源性神经干细胞的变化。对部分大鼠受损侧脑组织进行Western Blotting,检测其中神经生长因子(nerve growth factor, NGF),脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), caspase3, Nestin及Neurocan的表达,以定量了解移植后受损环境中这些因子的表达情况。此外,利用转染技术将绿色荧光蛋白标记移植细胞,移植后用GFAP标记反应性胶质细胞,从而观察移植细胞与胶质疤痕之间的关系。最后采用SPSS18.0软件对所有数据进行统计学分析。结果:成功从SD大鼠腹股沟脂肪组织中分离出ADSCs,在体外培养获得增殖和传代。诱导分化出的类施万细胞,呈现典型施万细胞形态,并表达施万细胞特异性标志物GFAP, S100以及P75。依照我们的方法捣损运动皮层,能建立对侧不全偏瘫模型。将ADSCs来源施万细胞移植后,发现ADSCs-SCs能够大幅度改善偏瘫大鼠术后运动功能。进一步的研究发现,ADSCs-SCs可以动员内源性神经干细胞增殖,促进神经营养因子NGF, BDNF的分泌,抑制凋亡,减少胶质疤痕形成,减少抑制性因子Neurocan的分泌。结果与对照组比均有统计学意义。结论:1.ADSCs-SCs移植大大改善运动皮层损伤的偏瘫大鼠模型术后运动功能。2.ADSCs-SCs在体内可以促进内源性神经干细胞的增殖;3.ADSCs-SCs在体内可以促进神经营养因子NGF, BDNF的分泌;4. ADSCs-SCs在体内可以抑制caspase3途径相关凋亡;5.ADSCs-SCs在体内可以减少胶质疤痕形成,并减少其相关因子Neurocan的分泌。
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