吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)是我国南部沿海以及世界重要的养殖鱼类，食用价值和经济价值非常高。由于近年来养殖环境的恶化及养殖密度的增加，多种疾病相继发生，以链球菌病尤为突出，对罗非鱼养殖业造成了巨大的影响。免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是鱼类免疫系统应答中起到关键作用的体液因子。为了研究在外界病原菌感染吉富罗非鱼过程中，Ig基因在宿主免疫应答中的作用机制，我们分别对sIgM及mIgD这两种基因进行分子克隆、表达特征分析以及功能方面进行了研究。1.以灭活的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）诱导后的吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）为材料，构建其头肾SMART cDNA文库，应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼（O. niloticus）分泌型免疫球蛋白M（sIgM）以及膜结合型免疫球蛋白D（mIgD）重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1921bp，开放阅读框（ORF）为1740bp，5’端非编码区（5’-UTR）41bp，3’端非编码区（3’-UTR）140bp，编码579个氨基酸，N端有信号肽结构。预测分子量（MW）为64.26ku，理论等电点（PI）为5.36。系统进化树分析显示，吉富罗非鱼（O. niloticus）sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。mIgD全长3347bp，开放阅读框包含3015bp，编码1004个氨基酸；预测分子量（MW）为110.9ku，理论等电点（PI）为6.24。mIgD基因由可变区和恒定区两部分组成，可变区具有典型的V-D-J结构，恒定区先后由μ1、CH1-CH2-CH3-CH4-CH5-CH6-CH7和跨膜区(TM)组成。重链恒定区CH1-CH7氨基酸序列同源性比对结果显示吉富罗非鱼IgD恒定区与庸鲽（64%）同源性最高，CH1~CH7相似性分别为53%、56%、45%、57%、63%、69%、69%，TM结构域相似性为54%。2.利用Real-time PCR（qPCR）技术对无乳链球菌诱导前后的吉富罗非鱼sIgM及mIgD基因的组织分布差异以及在不同组织中的时间表达差异进行分析。结果显示，健康罗非鱼体内，sIgM主要在肠、脾脏、头肾和鳃中表达，而在肌肉、脑和心脏中几乎不表达；而mIgD主要在头肾、脾脏、胸腺和肾脏中表达，而在肌肉、性腺、脑和心脏中几乎不表达。在经过灭活的无乳链球菌免疫36h后，sIgM和mIgD基因的表达量在绝大多数组织中都发生上调，并且在一些免疫器官如头肾、脾脏、胸腺中的表达量显著高于健康组织中。在本实验所设置的时间段内，sIgM和mIgD的表达模式非常相似，均在肠、皮肤、鳃中最先表达，分别于24h之前达到峰值；而在其他免疫器官或组织如胸腺、头肾、脾脏和肾脏中，在经灭活的无乳链球菌免疫36h后才陆续达到峰值。3.将吉富罗非鱼sIgM基因的恒定区部分和mIgD基因恒定区序列分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒pET28-μ-M和pET32--D，经IPTG诱导后它们在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达。表达条件优化后，利用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化出约52.37ku的sIgM和99.9ku的mIgD融合蛋白。Western blot分析发现sIgM和mIgD融合蛋白都可与鼠抗His-Tag单克隆抗体特异性结合，表明目的蛋白成功表达。利用纯化的sIgM融合蛋白，按常规方法免疫新西兰大白兔，制备了兔抗SIGM多克隆抗体。ELISA检测显示，所获得的抗血清效价达到1:256000。4.为进一步研究sIgM在吉富罗非鱼体内主要免疫器官的分布，应用制备的多克隆抗体SIGM对吉富罗非鱼肠、脾脏、头肾及鳃组织进行了免疫组织化学分析。结果表明，在肠和鳃组织中，阳性信号存在于富含粘液细胞的上皮细胞层表面，而在杯状细胞中则不存在；而在脾脏和头肾组织中，阳性信号则特定存在于淋巴细胞中。为确定SIGM在亚细胞水平上的定位，本实验采用胶体金免疫电镜技术对吉富罗非鱼肠、鳃组织的上皮细胞及脾脏器官的淋巴细胞进行分析。结果表明SIGM主要存在于肠上皮细胞膜附近，并且在肠组织上皮细胞膜表面的微绒毛处含量较多在鳃上皮组织中，SIGM主要存在于包围鳃丝和鳃小片的上皮细胞及部分红细胞内；而在脾脏组织淋巴细胞内部高尔基体的分泌小泡处存在大量的胶体金颗粒。以上研究结果表明sIgM在鱼体粘膜免疫中发挥重要作用，为探讨鱼类sIgM的特性及功能奠定基础，并丰富了鱼类粘膜免疫的研究内容。