研究背景肠道损伤与肠粘膜屏障功能改变密切相关，特别是肠粘膜生物屏障及免疫屏障日渐受到重视。炎症性肠病(Inflammatory Bowl Desease，IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)的发病与遗传背景、免疫调节失控和个体差异以及环境因素等多方面原因有关，但最终表现为肠粘膜对肠道微生物抗原免疫反应失常而导致肠粘膜损伤和破坏。资料显示，IBD发病率逐年增高，已成为严重影响患者生活质量的常见疾病。IBD的传统治疗主要是针对肠道微生物感染和免疫系统的激活，以非特异性抗炎药物和免疫抑制剂为主，并辅以抗菌药物。临床观察发现，上述疗法存在明显的药物毒性反应和全身性副作用，特别是针对顽固性CD的治疗仍缺乏有效的措施，不能改变CD的自然病程。近年来的研究表明，CD的生物是调整各种炎症因子水平的有效方法，但确切疗效及生物安生性尚待关注。新近研究显示，CD发生的机制可能与肠道先天免疫反应缺陷以及中性粒细胞、巨噬细胞功能受损有关；重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)可通过增强中性粒细胞的趋化性、单核巨噬细胞的功能而调节肠道自然免疫状态，从而对CD的治疗发挥作用。目前临床应用或研究的重组hGM-CSF主要是把编码hGM-CSF的cDNA与相应表达载体构建重组质粒并转化于大肠杆菌、酵母菌、减毒沙门氏菌及腺病毒等得来，用药途径为经皮下注射，存在一些全身毒副作用。肠道粘膜免疫及系统免疫可由不同组群的肠道共生菌(Commensal bacteria)调节。乳酸链链菌(Streptococcus lactis；Lactococcus lactis)为肠道共生菌，属于相对安全菌株(generally regard as safe，GRAS)，它可改善胃肠微生态平衡，抑制肠道致病菌粘附及肠粘膜对细菌易位的易感性而加强肠粘膜屏障功能。由于该菌具有不产生内毒素而且产生的蛋白酶远少于大肠杆菌等优点，同时经改造后的乳链菌耐酸、耐胆汁，因而被大量用于表达多种生物多肽或蛋白。近来，SteidlerL et al，Vandenbroucke K etal相继成功构建了能经口服投递到肠道分泌表达有活性的hIL-10、hTFF蛋白的重组乳链菌并用于实验性结肠炎的治疗，取得了一定的疗效。目前国内外尚无重组hGM-CSF乳酸链球菌的报道。目的及意义构建能在肠道直接分泌表达hGM-CSF活性的重组乳酸链球菌，经口服用于克罗恩病动物模型的治疗，以期为克罗恩病的治疗提供更理想的途径。重组hGM-CSF乳酸链球菌可以同时发挥hGM-CSF和乳酸链球菌的肠粘膜保护作用，并具有可在局部表达活性、无抗原性、使用安全、服用方便、便于大规模生产等优点，可能发挥更佳的治疗作用。主要内容及方法、结果本课题中，参照GenBank公布的序列，设计及构建乳链菌分泌型表达系统；采用了基因拼装(PCR based gene assembly，PBGA)及基因克隆(gene cloning)技术优化了hGM-CSF的基因编码，并体外合成了hGM-CSF cDNA：构建了hGM-CSF乳酸链球菌表达载体pTRCSF；获得表达hGM-CSF的重组乳链菌LL-CSF；为验证hGM-CSF的重组乳链菌能否在肠道定植并分泌表达，同时又构建了其带绿色荧光的表达载体pTRCSFGFP及重组菌LL-CSFGFP；通过体外细胞试验检测了重组hGM-CSF乳酸链球菌中hGM-CSF的蛋白表达及其活性：最后经动物试验评价其对TNBS诱导的大鼠结肠损伤(发病机制及病理改变类似人类CD)的保护作用。一、重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建1、乳链菌表达系统pPUS的构建按照GenBank公布的序列，选用适合于乳链菌中使用的乳酪链球菌的p59启动子作为启动子，选用乳链菌分泌型蛋白45(USP45)的核糖体结合位点(ribosome binding seqence，RBS)和信号肽序列作为RBS和信号肽：选用Usp45基因的终止子作为终止子；在信号肽后插入多克隆位点(multiple cloningsite，MCS)，设计并构建乳链菌分泌型表达载体系统pPUS。采用基因拼接技术拼接带有乳链菌的P59启动子、USP45的RBS、编码USP45信号肽及其终止子、多克隆位点的基因序列连接到pGEM-T easy载体，经测序正确后亚克隆于载体pBluescriptⅡSK(＋)，得到带有乳链菌分泌型表达系统的质粒pPUS，测序结果显示与设计完全一致。2、hGM-CSF基因的体外拼装根据已知的人的hGM-CSF氨基酸序列(GenBank登录号：AAA52121)并结合乳酸链球菌蛋白表达密码子来设计合成hGM-CSF cDNA序列，参照pPUS的酶切克隆位点碱基序列，分别在5’和3’端分别设计BamH I和Pst1酶切位点，以便进一步亚克隆目的基因片段到各种表达载体和DNA测序。Internet在线进入DNAWORKS程序，根据该程序指导，将上述目的基因全长碱基序列输入，该程序自动将目的基因序列设计成16个可以相互重叠的cDNA寡核苷酸片段，通过PCR(polymerase chain reaction)反应，获得hGM-CSFcDNA，再TA克隆到pGEM-T easy载体，阳性克隆经测序与设计完全一致。3、hGM-CSF乳酸链球菌表达载体pTRCSF、pTRCSFGFP的构建用PstI／BamH I分别对乳链菌分泌型表达系统的质粒pPUS和拼接后TA克隆得到的质粒hGM-CSF进行双酶切反应，获得带PstI和BamH I的粘端的hGM-CSF和pPUS，通过连接反应，将hGM-CSF插入pPUS，转化于Top10大肠杆菌，得到过渡克隆载体pPUSCSF，经测序完全正确。再用XbaI／SacI对pPUSCSF进行双酶切获得PUSCSF基因片段，插入用XbaI／SacI双酶切后的穿梭载体pTRKH2，转化于Top10大肠杆菌，经酶切鉴定获得阳性克隆，得到可以分泌表达hGM-CSF的乳酸链球菌表达载体pTRCSF。同时，为了后期验证重组hGM-CSF乳酸链球菌能否在实验动物肠道定植表达，通过PCR扩增增强型绿色荧光表达蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)并进行T-A克隆，测序正确后命名为sDGFP并插入pPUSCSF得到过渡克隆载体pPUSCSFGFP，再按前述同样的方法构建了乳酸链球菌表达载体pTRCSFGFP。4、构建重组hGM-CSF乳酸链球菌将乳酸链球菌LL-1403株制成感受态细胞，用电穿孔方法将pTRCSF、pTRCSFGFP转入LL-1403，成功构建了重组hGM-CSF乳酸链球菌LL-CSF、LL-CSFGFP。保种后提取质粒，Xba I／SacI双酶切鉴定结果证实pTRCSF、pTRCSFGFP成功转入LL-1403。同样方法将pTRKH2转入LL-1403，构建空质粒乳酸链球菌(LL-pTRKH2)作为对照。二、hGM-CSF在重组乳酸链球菌LL-CSF中的表达及其生物活性检测先提取LL-CSF、LL-pTRKH2、LL-1403的总菌蛋白和上清蛋白进行SDS-PAGE及Western bolt，了解蛋白表达情况；观察LL-CSF和LL-pTRKH2上清液对hGM-CSF依赖的细胞株人红白血病细胞TF-1细胞的增殖效果，并用CCK-8试剂盒检测LL-CSF的蛋白活性，用已应用于临床的国产重组hGM-CSF里亚尔(Leubene)作为阳性对照，用细胞培养液作阴性对照。1、hGM-CSF在LL-CSF中的表达分别取LL-CSF、LL-pTRKH2、LL-1403 GM17保种菌液10μl，接种于含2mlGM17培养液中，30℃培养24h，菌液在600nm吸光度0.8左右结束培养；提取上清蛋白和总菌蛋白进行SDS-PAGE，发现LL-CSF培养上清蛋白和总菌体蛋白形成分子量约为16.4kDa(hGM-CSF为14.4 kDa另加USP蛋白)的明显外源带；用抗hGM-CSF单克隆抗体进行Western blot，证实16.4kDa相应位点有特异性蛋白印迹；LL-pTRKH2、LL-1403均无外源蛋白表达。结果表明，重组hGM-CSF乳酸链球菌LL-CSF可以分泌表达hGM-CSF蛋白。2、hGM-CSF的蛋白活性检测用GIBCO公司RPMI-1640细胞培养液培养LL-CSF、LL-pTRKH2，取其上清液过滤，观察他们对hGM-CSF依赖的细胞株人红白血病细胞TF-1细胞的增殖效果，并用CCK-8(MMT的升级替代品)试剂盒检测LL-CSF的蛋白活性，用已运用于临床的国产重组hGM-CSF里亚尔(Leubene)作为阳性对照。(1)细胞培养及增殖试验先将TF-1细胞在含重组hGM-CSF里亚尔20ng／ml的RPMI-1640-10％FBS-10％Pen／Strep细胞培养液中进行传代培养。用无血清的RPMI-1640将生长状态良好的TF-1细胞洗涤3次，加入6个盛有30ml上述细胞培养液的培养瓶中，再分别加入不同量处于对数生长期(在600nm吸光度0.8，5×10~9CFU／mL)的LL-CSF、LL-pTRKH2上清液，另外1瓶加里亚尔600ng(4μl)，1瓶只用RPMI1640细胞培养液，置入细胞培养箱培养；倒置显微镜下观察发现培养到48h后，加LL-CSF上清液和加里亚尔组的TF-1细胞均见明显增殖，说明LL-CSF分泌表达的hGM-CSF具有生物活性。(2)LL-CSF的蛋白活性测定用含10％FBS的RPMI1640将rhGM-CSF里亚尔稀释至25ng／ml，将上述LL-CSF上清稀释成5μl／ml，逐级按0.8倍稀释稀释后分别取100μl置入96孔板中。收集处于对数生长期的TF-1细胞，使用PBS洗涤3次后重悬于含10％FBS的RPMI1640中，调整浓度为2×10~4细胞／ml，接种于上述96孔培养板中，每孔100μl，37℃，5％CO2培养48 h，每孔加入CCK-8溶液20μl。再在培养箱中继续孵育，2h后用酶标仪在450nm波长测定吸光度。结果表明每5μl LL-CSF上清分泌表达的hGM-CSF蛋白活性相当于18ngrhGM-CSF里亚尔的比活性。三、重组hGM-CSF乳酸链球菌对TNBS诱导的大鼠结肠损伤的保护作用观察灌食重组菌LL-CSFGFP后SD大鼠结肠膜菌的绿色荧光蛋白表达情况，以证实重组hGM-CSF乳酸链球菌可以在大鼠结肠定植并分泌表达。而后，用三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)制备SD大鼠结肠炎动物模型。此模型组织学及发病机制类似人类克罗恩病(crohn’s desease，CD)。根据已知的TNBS诱导的实验性结肠炎的病理组织学过程及前面的实验结果，确定干预和观察时间段，比较各组大鼠一般情况、体重变化、病理评分、部分细胞因子的表达情况，探讨重组hGM-CSF乳酸链球菌LL-CSF对TNBS诱导的实验性大鼠结肠损伤的保护作用。1、重组hGM-CSF乳酸链球菌在大鼠结肠的定植和表达验证8只清洁级SD大鼠，体重约180g／只，雌雄不限，常规饲养1周后于第1、3、5、7天分别灌食对数生长期(OD值约0.8)的LL-CSFGFP菌液1ml(5×10~9CFU)，每次灌食2只。于第8天处死，用4℃生理盐水将肠腔内容物冲洗干净后，取结肠组织2克行膜菌培养。对膜菌经红霉素抗性筛选培养出的乳酸链球菌接种培养后行激光共聚焦检测，发现第7天灌食LL-CSFGFP的大鼠结肠膜菌经红霉素平板筛选有乳链菌菌落生长、激光共聚焦检测部分有绿色荧光；第1、3、5天灌食LL-CSFGFP的大鼠见少许乳链菌菌落生长但未见荧光。证实我们构建的重组hGM-CSF乳酸链球菌可以在实验大鼠结肠定植并表达外源蛋白，但其体内稳定性还待进一步探讨。2、模型制备、分组32只清洁级SD大鼠，体重约180g／只，常规饲养1周，实验前禁食1天。随机分为正常组、生理盐水组、LL-pTRKH2组、LL-CSF组，每组8只，雌雄各半。除正常对照组外，用3％戊巴比妥钠腹腔注射0.1ml麻醉后，经大鼠肛门分别注入0.9ml(125mg／kg．w)的5％TNBS(终浓度2.5％)／乙醇(终浓度50％)混合液，灌肠后动物平躺、自然清醒，10h后进食、进水。3治疗组分别于制模后第2天开始每天分别予以1ml生理盐水、1ml LL-pTRKH2、1ml LL-CSF(5×10~9CFU)灌胃。3、一般情况观察和标本采集每天记录各组大鼠精神状态、进食、活动、大便等情况，所有大鼠于第8天处死。LL-CSF治疗组大鼠一般情况及体重变化明显好于其他治疗组。肉眼观察腹腔病变情况、肠管大小及浆膜病变，取距肛门1cm以上长约10cm的结肠，沿纵轴剪开，用4℃生理盐水将肠腔内容物冲洗干净，观察大鼠肠粘膜的大体病理变化，即取部分病变组织和／或周边组织，正常组取大致相同部位组织，一部分用10％甲醛固定待行HE染色，作组织病理学观察和免疫组织化学观察各组大鼠肠组织中COX-2、PCNA的蛋白表达情况；另一部分立即储存于-80℃低温冰箱，用RT-PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12p35、IL-12 p40、IFN-γmRNA的表达情况。4、主要指标观察(1)病理学变化各制模后治疗组大鼠均见局部结肠粘膜充血、出血、糜烂和／或溃疡，部分大鼠出现肠管扩张、渗出、粘连。正常对照组大鼠腹腔及肠道未见明显病变。组织病理学观察发现各治疗组大鼠均出现不同程度的粘膜上皮破坏或粘膜缺损，粘膜下中性粒细胞浸润，大部分大鼠见出血病灶、隐窝破坏或出现脓肿、肠壁全层炎症浸润、溃疡。LL-CSF组大体病理和病理组织学评分均明显低于其他2个治疗组(P＜0.001，P＜0.001)，LL-pTRKH2组大体病理和病理组织学评分低于生理盐水组，但无统计学意义(P=0.340，P=0.397)。(2)大鼠肠组织中COX-2、PCNA的蛋白表达情况免疫组织化学观察发现，正常对照组COX-2、PCNA蛋白表达分别呈阴性和弱阳性；各治疗组大鼠肠粘膜均见COX-2和PCNA蛋白表达，COX-2主要为胞浆表达，PCNA为胞核表达；其中LL-CSF组COX-2的表达呈阳性，PCNA的表达呈强阳性；LL-pTRKH2组和生理盐水组的COX-2均呈强阳性表达，PCNA均呈阳性表达。(3)大鼠肠组织中细胞因子IL-6、IL-18、IL-12p35、IL-12p40、IFN-γ的mRNA表达情况用RT-PCR方法检测发现，各治疗组肠组织IL-6、IL-18、IL-12p35、IL-12p40、IFN-γmRNA的表达均显著高于正常对照组(P＜0.001)；治疗组间IL-12p40、IL-18mRNA的表达无显著性差异(P＞0.050)；LL-CSF组IL-6、IL-12p35、IFNγmRNA的表达均显著低于其他治疗组(P＜0.050)。动物实验结果表明：细胞因子IL-6、IL-18、IL12p35、IL12p40、IFN-γ参与了TNBS诱导的大鼠实验性结肠炎的病理生理过程；再次证实该动物模型类似人类克罗恩病，属TH1型细胞因子介导的的结肠炎；重组hGM-CSF乳酸链球菌对TNBS诱导的大鼠结肠损伤有明显的保护作用，并与下调IL-6、IL-12p35、IFN-γmRNA表达有关。结论1成功拼接了hGM-CSFcDNA及乳酸链球菌分泌型表达系统基因PUS。2成功构建了乳酸链球菌分泌型表达系统pPUS。3成功构建了重组hGM-CSF乳酸链球菌的克隆载体pPUSCSF、pPUSCSFGFP，表达载体pTRCSF及其验证载体pTRCSFGFP。4成功构建了重组hGM-CSF乳酸链球菌LL-CSF。5重组hGM-CSF乳酸链球菌LL-CSF在体外能分泌表达有生物活性的hGM-CSF蛋白。5重组hGM-CSF乳酸链球菌可以在肠道定植并分泌。6细胞因子IL-6、IL-18、IL12p35、IL12p40、IFN-γ参与了TNBS诱导的大鼠实验性结肠炎的病理生理过程。7重组hGM-CS乳酸链球菌LL-CSF对实验性结肠损伤有明显保护作用，并与下调IL-6、IL-12 p35、IFN-γmRNA表达有关。