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本研究运用体细胞核移植的原理和技术，以成年大鼠的成纤维细胞为供体，去核小鼠和牛成熟卵母细胞为受体，构建种间核移植重组胚胎，研究种间体细胞核移植胚胎的构建方法和重组胚胎的体内外发育潜能及其影响因素。并重点讨论影响种间核移植重组胚胎发育的主要因素。主要内容和结果如下： （一） SD大鼠成纤维细胞系的建立 将单细胞显微法改进为单细胞集落克隆纯化，能快速、有效建立细胞系，并可获得92.71％克隆率。 （二） SD大鼠成纤维细胞的同步化处理和核型分析 利用流式细胞仪检测可知，经血清饥饿法同步处理的大鼠成纤维细胞，G0+G1期细胞百分比提高到74.5±4.4％；而用nocodazole法能使45.9±5.21％的细胞同步于G2／M期，两种方法均显著（P<0.05）。核型分析显示大鼠原代和传代成纤维细胞染色体数目（2n=42）和形态一致。 （三） 大鼠-小鼠种间体细胞核移植研究主要结果 1．直接注射法和融合法构建的重组胚桑椹胚发育率分别可达9.84％、9.48％。1500～M800V／cm,30ms脉冲条件可使70％以上的重构胚融合，低场强、大脉冲（1000V／cm,100～200ms）也能使60.0～78.24％的重构胚胎融合。 2．改良CZB培养基能更好地支持重组胚的发育，桑椹胚发育率可达10.93％。 3．未经处理、血清饥饿3-5d、10±5μg／ml nocodazole处理的大鼠成纤 第四军医大学硕士学位论文 雏细胞做供体构建重组胚胎，分别得到 4．14％、6．45％、2．94％的囊肚发育率。 4．研究发现 10土5 u g／ml的 CCB有利于去核(去核率为 88．23％L 6－DMAP＋乙醇＋CCB能有效地激活种间核移植重构胚。 5．将255枚2－细胞以上的核移植重构肚，移植给46只SD假孕鼠，均未 妊娠。 （四）大鼠－牛种间体细胞核移植研究的主要结果 牛卵母细胞在含8－10％发情牛血清（OCS）的成熟培养基培养22－24h，能 使60．86％－61．41％的卵母细胞达到成熟：在1500－1800V／cm，30－40sin条件下， 大鼠－牛核移植重构胚能达到 50厂0－55．08％融合率：血请饥饿法和 nocodazole 法处理的供体细胞构建的重组胚胎，经6－DMAP＋乙醇＋CCB激活，分别获得 17．33O和 17．02O的卵裂率以及6．60O和8．50o的桑堪胚发育；重组胚胎在 MI 99和改良的 CZB中培养，分别获得 16．41O和 17．41o的卵裂率以及 7．46o 和 6．7 4O的囊胚率。 结论：本研究在国内首次进行大鼠－小鼠和大鼠－牛种问体细胞核移植探 索，初步建立种间体细胞核移植重组胚的构建方法，并获得发育至桑堪胚的大 鼠－小鼠和大鼠－牛胚胎，但没有得到囊胚。重组肚移植给受体动物均未妊娠。 说明小鼠和牛的去核成熟卵母细胞质能支持大鼠成纤维细胞进行发育程序重 编，但不能维持重组胚胎的囊胚发育和妊娠。此外，重组胚胎的构建、卵母细 胞的质量、供体细胞的预处理、激活方法、培养体系等回素都影响异种核移植 胚胎的发育。