菊花再生体系的建立及农杆菌介导绿色荧光蛋白(GFP)基因转化的研究

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本研究以菊花(Dendranthema morifolium)品种‘日本黄’、‘阳光’、‘国华积富’为试验材料,研究了不同品种、不同激素浓度配比对菊花愈伤组织、不定芽和根诱导的影响。优化了菊花再生条件,获得了菊花叶片高效再生体系。试验结果表明,品种‘日本黄’的再生能力明显高于其他两个品种,并筛选出诱导愈伤组织、不定芽和根的最佳培养基。研究中同时也发现,品种‘日本黄’叶片接种在MS+NAA(1mg/L)+6-BA(3mg/L)培养基上,经过一段时间的培养,可直接再生出不定芽,并且芽诱导率高达100%,繁殖系数达8.54,再生芽在1/2MS+NAA(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)培养基上经过10天左右可诱导出根,生根率可达100%,完全可以满足遗传转化的需要。在建立了菊花品种‘日本黄’再生体系的基础上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行遗传转化研究。试验结果表明,叶盘预培养、农杆菌菌液OD600值、侵染时间和共培养时间均对菊花的遗传转化率有较大影响。同时得出不经过预培养、OD600=0.6、侵染10分钟和共培养4天菊花遗传转化率最高,同时考虑了滤纸帽法对转化率的影响。共培养后把叶盘转入MS+ NAA(1mg/L)+6-BA(3mg/L)+Km(30mg/L)培养基上进行分化筛选培养。30天后可分化出不定芽,把不定芽转到MS +NAA(1mg/L) +6-BA(3mg/L) +Km(50mg/L)培养基上进行抗性芽的筛选,转到1/2MS+NAA(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Km(25mg/L)培养基上进行生根筛选。把经抗性筛选得到的转基因苗通过PCR扩增表明,转基因植株中可以检测出有目的基因GFP基因的存在,目的基因已成功插入到菊花的基因组中。
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