目前，抗体片段Fab在治疗人类多种疾病（如癌症、病毒感染、炎症等）方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区，因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制，在短时间内可以获得高产量，因此，已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是，在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低，原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集，形成无生物学活性的包涵体，且宿主菌中含有多种蛋白酶，对Fab有一定的降解作用等。因此，为提高抗体产量，可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手，以期达到理想目标。　　本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1）在实验室前期工作基础上，以E.coli DH11T7为宿主菌株，通过构建不同的Fab表达载体，最终提高Fab在E.coli中的产量;2）在1）工作的基础上，通过共表达多种分子伴侣，进一步提高Fab在E.coli中的产量;3）在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DH11-ptr-degp（以下简称86D）的基础上，对其基因组上spr（extragenic suppressor，抑制prc基因缺陷造成的菌体过早裂解）基因H145A位进行单个氨基酸突变，获得突变菌株86D-Mspr，同时共表达优势Fab表达载体及分子伴侣，最终通过发酵实验，提高Fab在E.coli中的产量。　　对于Fab表达载体的构建，主要对信号肽进行优化。尤其是重链信号肽DsbA及STII，通过改变信号肽翻译起始区(translation initiation region，TIR)强度，将获得的13个重链片段分别与PelB-LC连接至pET-3b载体骨架，经ELISA分析获得了Fab最优表达载体的组合DsbA8+HC+PelB+LC(pET-DH8PL)，总产量约14mg/L左右。通过进一步构建单一分子伴侣表达载体及多个分子伴侣表达载体，能够在一定程度上改善Fab在E.coli中的分泌表达，尤其当以p15c-FkpA-SurA组合时，Fab产量可达到20mg/L左右，产量提高了30％。将宿主菌株由E.coli DH11T7替换为E.coli周质蛋白酶缺陷菌株86D时，抗体片段Fab的产量可提高20％左右。　　E.coli属于原核表达系统，其发酵工艺相对简单，对表达宿主的大规模培养是为了获得大批量的抗体蛋白。本课题在实验室所构建的Red无痕敲除法的基础上，用类似的方法完成了对E.coli86D spr H145A单个氨基酸的突变，获得了基因组突变菌株86D-Mspr。第一步，将构建的供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB与辅助质粒pAAICDGBE共转入E.coli86D中，在L-阿拉伯糖的作用下，诱导表达Ⅰ-CreⅠ核酸内切酶和Red重组酶。Ⅰ-CreⅠ酶切割供体质粒上的左右同源臂及Cm抗性基因，并在Red重组酶的作用下，进行同源重组，最终在E.coli86D基因组上成功整合Cm抗性基因。第二步，将辅助质粒SN3K转化至第一步含Cm抗性基因的E.coli86D中，同样在L-阿拉伯糖作用下，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶和Red重组酶。在Ⅰ-SceⅠ酶作用下，将基因组上的Is-Cm片段切除，同样在Red重组酶的作用下，左右同源臂与染色体发生同源重组，从而获得基因组突变菌株86D-Mspr。最终对其进行初步发酵工艺研究，在3L发酵罐中抗体片段Fab的产量可达到72mg/L左右。本工作为进一步提高抗体Fab产量打下了基础。