热应激破坏肠道屏障功能,导致肠道损伤。肠道上皮细胞中含有丰富的内质网,在应激状态下,内质网（ER）中蛋白质错误折叠增多,引发内质网应激。热应激是否会通过介导内质网应激调控肠道屏障功能尚不明确。海藻糖具有分子伴侣和抗氧化的的双重功能。因此,海藻糖将作为干预肠道细胞热损伤的营养素并研究其干预机制。本研究通过体外建立猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）热应激模型,利用转录组学结合免疫印迹和免疫荧光技术及透射电镜观察,并通过添加内质网应激抑制剂（4-PBA）和活性氧清除剂（NAC）,探究了短期和长期热应激引起细胞损伤的分子机制及海藻糖的干预作用。主要的试验结果如下:1.短期高温介导内质网应激调控IPEC-J2细胞凋亡的机制研究短期热应激（43℃,2h）处理会显著降低细胞存活率,显著增加乳酸脱氢酶（LDH）活性和凋亡率;通过转录组测序和KEGG通路富集分析,结果显示,短期热应激可激活内质网应激（ERS）信号通路,引发未折叠蛋白响应,抑制细胞增殖;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测发现,短期热应激引起ERS标志蛋白GRP78、ER信号通路蛋白p-PERK/p-e IF2α/ATF4/CHOP及凋亡标志蛋白active-caspase 3、BAX、Cyt c的表达量显著上调;透射电镜观察结果发现,短期热应激下内质网附着核糖体数量减少,内质网腔直径显著增加;对肠道屏障功能分析发现,短期热应激显著下调肠道紧密连接蛋白Claudin3、ZO1和Occludin的表达量。添加内质网应激抑制剂4-PBA预处理细胞后,与热应激组相比,内质网应激标志蛋白、通路蛋白和凋亡标志蛋白表达量显著降低,表明短期高温介导IPEC-J2细胞发生内质网应激性凋亡,破坏肠道屏障功能。2.长期高温介导氧化应激和内质网应激调控IPEC-J2细胞凋亡的机制研究长期热应激（43℃,12h）处理极显著降低细胞存活率和增殖率,显著降低细胞内SOD活性,极显著提高LDH活性、细胞内ROS含量、丙二醛（MDA）含量以及细胞凋亡率,极显著降低抗氧化相关蛋白SOD2、CAT的表达量,极显著降低抗凋亡蛋白BCL2的表达量,极显著提高促凋亡相关蛋白Caspase 3、BAX、Cyt c的表达量,结果表明热应激诱导细胞发生氧化应激和凋亡;通过转录组测序和KEGG通路富集分析,结果显示:谷胱甘肽代谢途径,烟酸和烟酰胺代谢途径,过氧化物酶途径,Wnt信号通路,MAPK信号通路和内质网应激信号通路参与长期热应激响应;透射电镜观察结果发现,热应激条件下线粒体嵴异常,内质网腔直径变大;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测发现,长期热应激引起内质网应激标志蛋白GRP78、ER信号通路蛋白p-e IF2α/ATF4/GADD34/CHOP的表达量显著上调。添加活性氧清除剂NAC预处理细胞后,结果显示:NAC显著缓解热应激诱导的ROS增加,显著提高了抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT的表达量;显著增加了GSH合成限速酶GCLM的表达量而降低了GSH降解酶CHAC1的表达量;结果表明热应激影响了酶和非酶抗氧化系统,抑制ROS的清除,加剧了氧化应激。与热应激相比,添加NAC显著降低了ERS标志蛋白GRP78、ER信号通路蛋白p-e IF2α/GADD34/CHOP及凋亡标志蛋白active-caspase 3和BAX/BCL2的表达量。结果表明热应激诱导氧化应激,诱发内质网应激,导致细胞凋亡。以上两方面的研究将为营养素干预热应激提供了新的思路。3.海藻糖干扰热应激诱导IPEC-J2细胞凋亡的机制研究基于以上机制研究,我们选择具有抗氧化和分子伴侣双重功效的营养素—海藻糖缓解热应激损伤。试验分为3组,分别为对照组（CON,37℃）、热应激组（HS,43℃）和添加剂组（热应激条件下,添加10和20m M海藻糖:HS+TRE10和HS+TRE20）,热应激时间为12h。与热应激组相比,添加10/20m M海藻糖显著降低了细胞内LDH活性,显著提高了细胞内SOD活性;显著提高细胞SOD2基因和蛋白的表达量。海藻糖显著提高了热应诱导的细胞自噬相关蛋白LC3、ATG5、Beclin1的表达量下降,促进细胞自噬。海藻糖可显著降低内质网应激相关蛋白GRP78、p-e IF2α、ATF4、CHOP的转录和蛋白水平的表达。海藻糖可显著提高肠道紧密连接蛋白ZO1、Claudin1的表达。综上所述,本研究得出以下结论:短期和长期热应激（43℃,2h和12h）均会介导内质网应激信号p-e IF2α-CHOP调控细胞凋亡。长期热应激导致氧化应激。添加10和20m M的海藻糖均能显著缓解氧化应激和内质网应激,保护肠道屏障功能。研究成果阐明热应激诱导的肠屏障功能损伤的新机制,为营养素干预提供了新思路。