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[目的]
筛选斑块型银屑病患者外周血T细胞差异表达基因,并对其中的T细胞受体β链可变区(T cell receptor beta chain variable region,TRBV)家族基因的优势表达情况进行分析,为进一步阐明银屑病作为一种T细胞介导的免疫性皮肤病这一论点提供依据。
[方法]
1、采用密度梯度离心法分离银屑病患者、扁平苔藓患者以及正常人外周血T细胞,并进行培养扩增；
2、提取RNA,制备Taq并测序；
3、根据参考基因数据库,利用软件生成参考标签数据库,将Clean Tag与参考标签数据库作比,对其中唯一比对到一个基因的标签进行基因注释；
4、参照数字化基因表达谱差异基因检测方法,筛选两样本间的差异表达基因；
5、以KEGG Pathway为单位,应用超几何检验,对差异表达基因中与整个基因组背景相比有显著性富集的Pathway进行分析；
6、选取银屑病患者和正常人外周血T细胞各20例,提取RNA,行逆转录反应；
7、设计合成TRBV基因家族上游引物及共同的TRBC下游引物,行实时荧光定量PCR(real—time fluorescence quantitative polyme rase chain reaction,RFQ—PCR),筛选TRBV基因优势表达。
[结果]
1、T细胞后培养扩增以后,抽取2—3×106细胞进行流式细胞技术,鉴定T细胞纯度达97.47％。
2、Taq测序筛选出了340万个clean Taq,其中约70％clean Taq唯一比对到一个基因。
3、在正常人与银屑病基因中筛选出3046个差异表达基因,其中1908个基因在银屑病患者外周血T细胞中表达增高。同样比较银屑病与扁平苔藓基因表达,筛选出2272个差异表达基因,其中1371个基因在银屑病患者中表达增高；而银屑病患者与正常人及扁平苔藓患者均存在表达差异的基因多达907个；
4、对筛选出的907个差异表达基因进行了Pathway显著性富集分析,其中418个基因在KEGG数据库中有Pathway注释,共参与170个Pathway,12个基因可以注释到T细胞受体信号通路;
5、银屑病患者外周血T细胞TRBV2、TRBV5—7、TRBV6—6／6—9、TRBV12、TRBV24及TRBV29表达显著高于正常对照,其中TRBV6—6／6—9、TRBV12、TRBV29确定为银屑病患者外周血T细胞优势表达的基因家族。
[结论]
T细胞在银屑病发病过程中的作用是广泛且复杂的,其中参与T细胞受体信号通路的异常基因表达及相关蛋白分子推测可能在银屑病皮损处起着重要的作用。进一步研究揭示TRBV优势表达模式与银屑病发病过程中T细胞特殊免疫效应的产生密切相关。