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[目 的]随着基因重组技术日益进步,细胞免疫治疗被认为是新世纪肿瘤治疗中最有前景的一种治疗方式,其中嵌合抗原受体T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T Cell Immunotherapy,CAR-T)因其靶向性和免除了 MHC限制性等优势具有广阔的应用价值。本研究针对CD19阳性的血液恶性肿瘤,建立抗CD19 CAR-T细胞培养体系并进行质量控制,通过体外实验评估抗CD19 CAR-T细胞靶向杀伤肿瘤细胞活性及其作用机制,为CAR-T技术在血液恶性肿瘤中的临床研究及应用提供实验依据。[方法]1.抗CD19 CAR-T细胞的体外培养及鉴定利用PiggyBac转座子(PB-CD19 CAR-puro)与转座酶方法,通过电转将构建的CD19质粒转染至PBMC细胞,经本实验室前期构建的人工抗原提呈细胞(atificial antigen presenting cell,aAPC)刺激培养系统选择性扩增,并加入细胞因子IL-2与IL-21后,得到大量增殖的CAR-T细胞。流式细胞仪检测CD3+CAR阳性率、亚群分群情况及中央记忆型T细胞(CD44十CD62L+)。2.抗CD19 CAR-T细胞的体外杀瘤活性及机制研究评估抗CD19 CAR-T细胞对自然表达CD19的NAMALWA细胞、Raji细胞(Burkitt’s淋巴瘤细胞),以及人工表达CD19阳性的K562细胞(慢性髓系白血病细胞)和CD19阴性表达的K562细胞的体外杀瘤活性。通过对穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ、TNF-α等细胞因子及其相关信号通路探究CAR-T的主要杀伤机制。3.抗CD19 CAR-T细胞体外安全性检测通过对残留aAPC、细菌、支原体、内毒素检测实现对抗CD19 CAR-T细胞构建培养体系的体外安全性监控。[结 果]1.抗CD19 CAR-T细胞体外培养及鉴定CD86CD64CD137LmIL-15CD19 aAPC 可稳定扩增抗 CD19 CAR-T细胞。利用本系统培养的抗CD19 CAR-T细胞,CD3+CAR阳性表达率在62.07±10.72%,中央记忆型 T 细胞(CD44+CD62L+)为 48.32±10.01%,CD4+CAR-T与 CD8+CAR-T亚群比例大约在1:1。2.抗CD19 CAR-T细胞的体外杀瘤活性及机制研究抗CD19 CAR-T细胞具有显著的CD19靶向性,能够靶向杀死CD19阳性的肿瘤细胞,其杀伤作用随效靶比(2:1、4:1、8:1、16:1)的递增而增强。进一步研究发现CAR-T细胞不仅释放IFN--γ、穿孔素、颗粒酶B发挥对肿瘤细胞的杀伤作用,还分泌如IL-2、IL-10、TNF-α等一系列炎性因子。电镜观察发现,CAR-T细胞利用伪足突触与肿瘤细胞Raji结合后,破坏肿瘤细胞膜形成孔洞造成肿瘤细胞死亡。此外,CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞时,凋亡相关蛋白caspase3的表达量下调,cleaved-caspase3、BAX、STAT1 的表达量上调。因此,抗CD19 CAR-T细胞可能通过激活IFN-y/STAT1信号通路、颗粒酶B介导的caspase3凋亡信号通路来杀伤肿瘤细胞。3.抗CD19 CAR-T细胞体外安全性检测抗CD19 CAR-T细胞混悬液中aAPC残留、细菌、支原体、内毒素皆呈阴性。[结 论]本研究建立的aAPC刺激培养体系可使抗CD19 CAR-T细胞大量扩增,CD3+CAR阳性表达率达62.07±10.72%,可靶向性杀伤CD19阳性血液恶性肿瘤细胞。以上杀瘤作用通过激活IFN-γ/STAT1信号通路、颗粒酶B介导的caspase3凋亡信号通路,为CAR-T细胞免疫治疗提供临床前实验基础。