大肠杆菌主要附生在人或动物的肠道里,是兼性致病菌,大多数在正常情况不致病,少数大肠杆菌可引起疾病。其中肠出血性大肠杆菌EHEC(O157:H7, O104:H4等)为产毒性肠道病原菌的一种,可以导致出血性肠炎和肾溶血性尿毒综合症,严重危害人类的身体健康。在治疗过程中一般采用支持疗法,不使用抗生素,因为,有许多文献报道,抗生素可刺激大肠杆菌等产生或释放志贺毒素,继而加重病情,增加出血性肠炎患者发展为肾溶血性尿毒综合症的机会。中药因其成分复杂,作用机理广泛,在感染性疾病治疗中发挥着重要作用,一直被用作寻求抗生素替代药物的重要资源库。因此,能否从中药中筛选到可用于治疗EHEC感染的有效药物,能抑制生物膜的形成,且不诱导stx2和eae等毒力因子的表达,成为本文的研究焦点。本文的主要研究内容和结果如下：1.筛选可以抑制细菌生物膜形成的中药体外条件下,采用微板法和试管法对鸡肠炎沙门氏生物膜进行了定量,试管法操作简单方便,重复性好,相对于微板法更适用于体外细菌生物膜的研究。通过试管法进行生物膜的定量,筛选得到了具有较好抑菌效果且能抑制生物膜形成的7种中药,山茱萸、五味子、秦皮、怀牛膝、生地、羌活和广木香。2.抗生素和中药饮片对大肠杆菌0157：H7毒力因子表达量的影响运用Real-time PCR的方法,在mRNA水平比较了抗生素(左氧氟沙星、链霉素、氯霉素、红霉素、四环素、头孢噻肟钠)和中药(黄连、秦皮、五味子、黄芩、广木香、生地、大黄、怀牛膝、山茱萸、羌活)在使用过程中对毒素基因stx2,eae和ygaG表达的影响,并用Elisa的方法对stx2在蛋白水平的表达进行了检测。2.1抗生素和中药饮片对大肠杆菌0157：H7的stx2表达量的影响大肠杆菌0157：H7产生的志贺毒素(Stx)有两种主要形式：Stx1(stx1基因编码)和Stx2(stx2基因编码),相比Stx1, Stx2毒性更强,与出血性肠炎和尿毒综合征的发生关系密切。mRNA水平的实验结果显示：抗生素作用于E.coli O157:H7后,链霉素,氯霉素和左氧氟沙星是stx2转录的有力诱导物,氯霉素的诱导能力最强,是对照组的1000倍以上；左氧氟沙星次之,是对照组的500倍,链霉素是对照组的400倍。与抗生素相比,中药对stx2转录和表达的诱导作用不大,诱导能力最强的是广木香,是对照组的6倍,远远低于氯霉素、左氧氟沙星、红霉素等的几百倍或上千倍。相反,黄连、怀牛膝和生地还抑制stx2的转录和表达。蛋白质水平上的检测结果趋势基本与荧光定量PCR的实验结果基本相符,氯霉素、链霉素和左氧氟沙星对志贺毒素蛋白的表达具有诱导作用,是对照组的10倍以上。有些中药饮片的实验结果与荧光定量PCR的实验结果略有出入,其中黄连在mRNA水平可以抑制stx2的表达,但蛋白水平的检测结果却表现出诱导作用,推测黄连可以通过增加细胞通透性增加志贺毒素蛋白的释放,并非通过促进stx2基因的转录和翻译,其余中药饮片的实验结果可能是中药饮片颜色引入的误差。2.2抗生素和中药饮片对大肠杆菌0157：H7的eae表达量的影响eae基因的编码产物Intimin能引起宿主上皮细胞的粘附和抹去损伤(A/E损伤),与大肠杆菌0157：H7的致病力密切相关。mRNA水平的实验结果显示：抗生素作用于E.coli O157:H7后,左氧氟沙星对eae的表达无明显影响,头孢噻肟钠在1/2MIC药物浓度下表现出抑制作用,其余药物浓度下表现出诱导作用,其余四种抗生素对编码紧密索的eae基因的表达具有抑制作用,最高可达对照组的上百倍。所选中药对编码紧密素的eae基因的表达均具有一定的抑制作用。2.3抗生素和中药饮片对大肠杆菌0157：H7的ygaG表达量的影响生物膜的形成能提高肠道病原菌的致病力,ygaG堪因的表达产物可以催化S-腺苷高半胱氨酸生成AI-2,与生物膜形成密切相关。mRNA水平上的实验结果显示：E.coli O157:H7后,头孢噻肟钠对生物膜形成相关基因ygaG的表达无明显影响,氯霉素对其表达具有抑制作用,其余四种抗生素对其表达均具有一定的诱导作用,最高可达到对照组的3倍,中药中1/2MIC药物浓度下,五味子,秦皮,黄芩和黄连表现出对ygaG基因表达的抑制作用,山茱萸,怀牛膝,生地,羌活和广木香具有诱导作用。3.抗生素和中药饮片对SOS反应的诱导作用运用SOS/umu检测体系对药物进行了体外致突变能力的检测,所选10种中药均没有对SOS反应的诱导作用；但是,某些种类的抗生素,如喹诺酮类的左氧氟沙星,对SOS反应的具有很强的诱导作用：氯霉素、链霉素和红霉素也有诱导作用。头孢噻肟钠和四环素则不表现诱导作用。中药对SOS反应没有诱导作用而抗生素有或强或弱的诱导作用,中药对STX表达的诱导作用较弱或没有诱导作用而抗生素的诱导作用强或者没有诱导作用,这两者的趋势是基本吻合的。药物是否能促进毒素的释放与细菌的SOS反应有关,DNA受到损伤后激活RecA蛋白,活化的RecA蛋白降解LexA和CI阻遏蛋白,CI的降解导致原先沉默的Stx编码基因活化表达,最终合成大量噬菌体分子,宿主细胞被裂解,Stx被释放出来。大肠杆菌0157：H7是肠出血性大肠杆菌的代表菌株,其致病性是多种毒力因子共同作用的结果。肠出血性大肠杆菌的毒力因子包括stx基因编码的志贺样毒素,eae基因编码的紧密素,hly基因编码的编码的溶血素等,此外还有与ygaG基因相关的生物膜。综合本文试验结果,可以看出：本文所选中药作用于肠出血性大肠杆菌0157：H7,对志贺样毒素蛋白的表达根本没有诱导作用,对编码紧密素的eae基因的表达均具有抑制作用,对生物膜的形成也具有一定的抑制作用。与所选抗生素相比,中药在治疗由大肠杆菌0157：H7引起的感染中具有相对优势,可能是筛选治疗肠道病原细菌引发感染的良好的新药资源。