意外创伤、慢性炎症和骨肿瘤等多种原因可以导致骨缺损。对于口腔颌面部的骨缺损,不仅影响咀嚼发音等功能,还影响美观,对患者的生理和心理健康造成严重的不良影响。因此,寻找一种有效的治疗骨缺损的方法成为国内外学者的研究热点。作为“金标准”的自体骨移植和异体骨移植存在来源有限、塑形性差和免疫排斥等不足,应运而生的骨组织工程在修复骨缺损促进骨再生方面表现了巨大的潜力。针对组织工程中的细胞因子这一因素,已知BMP和WNT信号通路是骨形成和再生过程中两条重要的信号通路。然而,单纯应用BMP或WNT蛋白,在骨缺损修复中的作用有限。研究表明,在骨形成和骨再生的动态过程中,这两条信号通路相互作用机制复杂,既可以相互协同又可以相互拮抗。在骨形成的动态过程中,WNT信号表达增高有利于干细胞的更新,而激活BMP信号能够促进成骨细胞的分化。因此,我们拟构建一种双层复合载药材料,通过顺序释放,先后激活BMP和WNT信号通路,可能达到发挥两信号通路协同作用抵消拮抗作用的目的。壳聚糖和海藻酸钠因其良好的生物相容性、促进细胞黏附和骨基质矿化等优点作为药物载体广泛应用。此外,由于BMP等细胞因子价格昂贵导致其无法大量应用,我们拟应用具有相同或相似作用的小分子化合物,FK506和BIO,分别是BMP和WNT信号通路的激活剂,并且能够促进细胞成骨向分化。因此,本课题旨在构建一种壳聚糖/海藻酸钠双层复合材料,使其负载BIO和FK506,达到顺序释放并顺序激活信号通路的目的,并研究了其在体外促成骨细胞分化作用,为未来临床修复骨缺损促进骨再生提供新的思路和理论支持。在第二章中,为了更好的发挥BMP和WNT信号通路促前成骨细胞成骨向分化的作用,我们测定了BMP信号通路激活剂FK506和WNT信号通路激活剂BIO的最适浓度。我们通过CCK-8法确定FK506和BIO对前成骨细胞系MC3T3-E1细胞活性无影响的浓度范围,通过ALP和茜素红染色法检测信号通路激活剂在安全浓度范围内对细胞成骨向分化的影响。我们发现在适宜范围内,对于早期碱性磷酸酶活性的作用,FK506较BIO的作用更强,且2μg/ml的FK506在各组中具有最强的促进ALP活性的作用;茜素红染色结果表明,0.1μM的BIO在各组中表现出最强的钙结节形成能力。在第三章中,为了达到BMP和WNT信号通路顺序激活的目的,我们制备了外层为海藻酸钠内层为壳聚糖的双层支架材料,利用扫描电镜观察其表面形貌,采用称重法测定材料的降解曲线,发现壳聚糖/海藻酸钠复合支架材料缓慢稳定降解至第35天以后;为了测定药物释放规律,我们制备了内层壳聚糖载BIO外层海藻酸钠不载药的支架材料、外层海藻酸钠载FK506内层壳聚糖不载药的支架材料,采用紫外分光光度法分别测定BIO和FK506的释放,结果发现FK506和BIO顺序释放,外层FK506在14天内基本释放完成,内层BIO在第5天开始释放,48小时内基本释放完成。在第四章中,为了进一步验证我们的假设,我们制备了内外负载不同药物的支架材料,利用ALP染色和茜素红染色法检测载药复合材料对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨向分化的作用,应用实时定量RT-PCR检测载药支架材料对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨相关基因表达的影响。我们发现内载BIO外载FK506的实验组相比于其他组碱性磷酸酶的活性更强,钙结节形成能力更强,且能显著促进成骨相关基因Runx2和Ocn的表达。综上,我们合成的海藻酸钠/壳聚糖双层复合支架材料结构稳定,合成了内层壳聚糖载WNT信号通路激活剂BIO外层海藻酸钠载BMP信号通路激活剂FK506的双层载药支架材料,使FK506和BIO顺序释放,能够在体外促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化,为临床修复骨缺损促进骨再生提供了新思路。