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脂肪组织过度发育,在畜牧上造成动物产品胴体品质下降,在人类则表现为肥胖并引发其他相关疾病如糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、高脂血症等。脂肪组织主要由脂肪细胞组成。脂肪细胞过度增殖、分化是导致体脂过度沉积的直接原因。脂肪细胞起始于中胚层多能干细胞,其分化过程为:多能干细胞—前体脂肪细胞—成熟脂肪细胞。过去30年里,利用已建立的鼠源性3T3-L1前体脂肪细胞系,人们发现了调控前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的各种转录因子,并对这些转录因子做了深入研究,但有关多潜能干细胞向前体脂肪细胞分化的研究较少。另外,随着后基因组信息学的发展,人们发现脂肪细胞分化的各种转录因子活性的启动并不是独立事件,而是受多种相同或者不同的细胞内、外因子及信号通路调控的过程。Wnt/β-catenin是新发现的调控脂肪细胞分化的重要通路。在此通路中,β-catenin蛋白对信号传递起关键作用。激活此通路可以抑制3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化。由于β-catenin及某些Wnt蛋白在3T3-L1前体脂肪细胞分化的早期高表达,因此,推测Wnt/β-catenin通路可能在多能干细胞向脂肪细胞分化中也起作用,但其具体作用及机制目前尚未见报道。猪是重要的肉用家畜,也是脂肪蓄积能力最强的动物之一,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。本文以猪脂肪间充质干细胞(ADSCs)为细胞材料,利用SQ RT-PCR、Western Blotting技术检测了Wnt/β-catenin信号通路主要成员在猪ADSCs向脂肪细胞分化过程中的时序表达情况;用Wnt/β-catenin信号通路的激活剂—LiCl处理猪ADSCs,并将细胞置于成脂诱导剂中培养,利用细胞免疫荧光染色、细胞油红O染色及油红O染色提取法、SQ RT-PCR及Western Blotting等技术研究了激活Wnt/β-catenin信号通路对猪ADSCs向脂肪细胞分化的作用及其机制;采用基因重组技术构建了Wnt/β-catenin通路的第二信使—β-catenin的逆转录病毒干扰载体并稳定转染猪ADSCs;利用细胞油红O染色及油红O染色提取法、SQ RT-PCR及Western Blotting等技术分析了阻断Wnt/β-catenin信号通路对猪ADSCs向脂肪细胞分化的影响。同时,采用“天花板”培养法获得猪去分化的前体脂肪细胞,利用细胞油红O染色、RT-PCR等方法检测了传代后前体脂肪细胞分化能力,并对这种前体脂肪细胞进行了细胞生物学鉴定。获得的主要研究结果如下:1.激活Wnt/β-catenin信号通路抑制了猪ADSCs向脂肪细胞分化的能力。LiCl增加了细胞内β-catenin蛋白的表达量,说明Wnt/β-catenin信号通路被激活;激活Wnt/β-catenin信号通路后,油红O染色的细胞数目减少,细胞内脂肪含量降低,而ADSCs向成骨细胞分化的能力增强;脂肪转录因子C/EBPα和PPARγ的表达受到抑制,而C/EBPβ和C/EBPδ等转录因子的表达未发生改变。2.阻断Wnt/β-catenin信号通路促进了猪ADSCs向脂肪细胞分化的潜能。敲除β-catenin后ADSCs向脂肪细胞分化的比例增加,细胞内脂肪含量升高,C/EBPα和PPARγ表达水平提高,并抑制了LiCl的抗脂肪细胞分化的作用。3.生理状态下,Wnt/β-catenin信号通路中的主要成员Wnt10,Frizzled1/2, GSK3β,β-catenin等基因在猪ADSCs中及ADSCs向脂肪细胞分化的早期均高表达,但随着成脂分化的进行表达量逐渐减少。4.成功构建了β-catenin的逆转录病毒干扰载体pSuper- retro-β-catenin shRNA,并将其转染到猪ADSCs中,经过嘌呤霉素筛选得到了稳定敲除β-catenin基因的细胞。5.分离、纯化得到猪ADSCs,经鉴定95%以上的ADSCs表达成体干细胞标志CD44和CD105;ADSCs在不同诱导剂中可分化成成骨、脂肪和成肌等细胞,具有多向分化潜能。6.成熟脂肪细胞可以去分化为前体脂肪细胞,传代后的前体脂肪细胞与原代培养的脂肪基质微管细胞(SVF)一样,有正常的增殖能力、可重新分化成脂肪细胞,但纯度和成脂分化率高于SVF。这种前体脂肪细胞冻存前后遗传性能良好,是一种很好的前体脂肪细胞模型。