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目的：肿瘤细胞对药物的耐受性已成为恶性肿瘤化疗失败的关键，而HepG2对顺铂选择性压力下耐药性方面的研究报道甚少。本研究目的是通过观察HepG2细胞在顺铂选择性压力下，细胞作出的选择结果。通过选择HepG2细胞顺铂耐药株建立中的某一阶段，动态观察HepG2在顺铂压力下的反应，观察存活细胞的内环境、细胞信号传导的可能起始位点，以及细胞对顺铂毒性作出的选择。最终对HepG2细胞如何耐受顺铂有一个较全面的了解。为寻找顺铂耐受的关键部位做好准备。同时对指导临床化疗提供依据。方法：第一部分： HepG2细胞顺铂耐药株的建立：采用早期倍增后期递增抗癌药(顺铂)持续作用的方法，建立HepG2/CDDP两个浓度下的耐药株，MTT法检测HepG2和Hep G2/CDDP对顺铂的抵抗能力。用免疫组化法和RT-PCR检测MDR(LRP、MRP)的表达，反映HepG2/CDDP的耐药性；透射电镜比较HepG2和HepG2/CDDP细胞超微结构的变化及不同。<WP=7>第二部分：观察HepG2在对顺铂耐受过程中胞内活性氧(ROS)的变化及对线粒体功能的影响：利用DCFH-DA(2’,7’-dichloro fluorescein-ciacctate)能直接被ROS生成发光荧光素的特性，在激光扫描共聚焦显微镜下原位实时检测，反映细胞内ROS的水平及变化。用反应膜电位荧光探针罗丹明-123（Rhodamine-123），在激光扫描共聚焦显微镜下，通过荧光强度测量耐药过程中线粒体膜电位的变化。用RT-PCR检测细胞色素C 、ATP酶mRNA的变化。反映细胞内环境和线粒体功能的变化。第三部分：凋亡相关基因在HepG2对CDDP耐受中的变化：用免疫组化法分别检测Bcl-2/Bax、PKC、PTr、TGF-βRII、c-myc、P53等表达。在图像分析仪下测量其显色强弱。用RT-PCR检测NF-κB mRNA的表达。结果：第一部分：1.成功建立两株HepG2/CDDP细胞，低度耐药的HepG2/CDDP0.4和中度耐药的HepG2/CDDP2.0。耐药指数分别为1.89和7.36；2. 低、中度耐药细胞的LRP表达均为阳性，中度耐药株的MRP为阴性；3. 亲本细胞和中度耐药株的超微结构上有差异。HepG2/CDDP2.0较亲本细胞含有丰富的高尔基复合体和较丰富的粗面内质网。但两株细<WP=8>胞的线粒体未见明显改变；第二部分：1.在形成低度耐药的过程中发现HepG2/CDDP0.4细胞内ROS在接触顺铂24h时明显升高，48h时下降，在72h后与亲本细胞相差无几。同样在24h时线粒体膜电位有明显下降，48h后渐恢复，至5天时与亲本细胞相差不明显；2. 细胞色素C、ATP mRNA经RT-PCR检测未见明显改变；第三部分：1. Bcl-2随顺铂处理而升高，但呈波动状；Bax随时间下降；Bcl-2/Bax相对比值呈时间依赖性明显升高；2.NF-κB mRNA在第5天时出现，第七天时明显升高；3.TGF-βRII随时间延长虽有波动，但总体仍较对照组明显增加；4. P53、C-myc、PKC、PTr均未见明显升高或呈强烈波动。结论：1. HepG2/CDDP2.0诱导成功，具有耐药细胞的生物学基本特征。所以选择耐药过程中的低度耐药细胞作为动态观察的模型是可行的，低度耐药模式与临床用药相近；2. 顺铂的细胞毒作用除对DNA的损害外，进一步证实还可引起细胞内ROS的升高。说明其细胞毒作用至少有两个方面；在HepG2与顺铂的持续接触中，细胞能主动克服ROS的损害，形成耐药细胞而存活，<WP=9>可能与谷胱甘肽(GSH)系统活性增加有关；其中耐药细胞内的主要抗凋亡因子—Bcl-2/Bax的比率明显升高，证明其是顺铂耐药形成的重要机制之一；NF-κB的滞后升高可能与LRP的产生有关。3. 首次发现顺铂耐药过程中TGF-βRII的明显升高。其升高的具体机理和意义不详。总之，本研究结果提示，顺铂耐药的机制主要是LRP使HepG2细胞内药物蓄积下降和细胞的抗凋亡能力增强。而早期以细胞的抗凋亡能力增强为主。顺铂应用中早期尤其是72h内的剂量是发生耐药的关键。用药早期若能有效降低细胞的抗氧化能力，防止耐药形成，或能进一步提高疗效，减少耐药的形成