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背景结核病(tuberculosis,TB)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的全球范围内的高感染率、高致死率的慢性传染病。尽管卡介苗(BCG)疫苗普遍应用和化疗药物有效性不断提高,但由于耐药性等问题的存在,结核病特别是耐多药结核(multiple drug resistant tuberculosis,MDR-TB)仍然严重威胁着人类的健康并给全球带来沉重的经济负担。MDR-TB是指结核病患者感染的结核分枝杆菌至少同时对异烟肼和利福平耐药。结核病的发病不仅与结核杆菌的数量、毒力有关,而且与宿主机体的免疫状态密切相关。细胞免疫(cell mediated immunity,CMI)是调节宿主和结核分枝杆菌相互作用的核心,CD4~+T细胞是介导细胞免疫反应的主要细胞,可以在不同细胞因子及环境因素作用下分化为Th1、Th2、Th17和Treg四种亚群,各细胞亚群之间可以互相转化,从而使机体的免疫效应和免疫抑制处于精细而复杂的平衡状态。结核病患者常存在Thl细胞免疫功能低下及Thl/Th2免疫应答失衡。调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是一种具有免疫调节功能的T淋巴细胞,可通过产生IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子,或依赖于细胞-细胞接触的机制,抑制效应性T细胞的活化、增殖及细胞因子的分泌。在慢性感染中,其关键作用在于调控病原体诱导的有效T细胞应答与导致严重炎症及组织破坏的过度T细胞反应之间的平衡,即调节抗感染免疫与免疫病理损害之间的平衡。基于Treg细胞的免疫抑制特性,多种病原体均能诱导宿主产生Treg细胞,利于病原体免疫逃避从而维持慢性感染。CD4~+CD25~+Treg细胞是目前研究较为深入的Treg细胞,但有关CD4~+CD25~+Treg细胞在MDR-TB患者体内的变化的研究鲜有报道。本研究着眼于Treg细胞,通过流式细胞技术、细胞共培养等实验方法,检测MDR-TB患者外周血Treg细胞的表达情况及功能状态,检测Treg细胞的表型改变,从负性共刺激受体分子介导的信号通路着手,进一步分析MDR-TB患者Treg细胞表达升高的原因,旨在阐明维持结核感染中的保护性免疫和病理损伤之间的平衡的机制,为临床免疫辅助治疗提供理论依据。第一部分耐多药肺结核患者外周血调节性T细胞的表达方法:选择20例药物敏感性肺结核患者(S-TB组)、18例MDR-TB患者和20例健康对照者(HC组),采用ELISA法检测外周血主要抑制性细胞因子IL-10、TGF-β含量;采用CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+CD25~+CD127~-两种方法标记Treg细胞,流式细胞技术观察外周血Treg细胞的表达,并进行相关性分析。结果:MDR-TB患者和S-TB患者外周血IL-10、TGF-β水平显著高于健康对照者(p<0.05),且MDR-TB患者血清IL-10、TGF-β水平高于S-TB组(p<0.05);MDR-TB组外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+CD25~+CD127~-T细胞比例均显著高于S-TB组(p<0.05),且CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞比例与CD4~+CD25~+CD127~-T细胞比例呈正相关(p<0.05);MDR-TB组IL-10、TGF-β水平与CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例正相关。结论:Treg细胞至少部分通过产生IL-10、TGF-β发挥免疫抑制效应;TB患者免疫功能受损程度与Treg细胞水平有关,且MDR-TB患者免疫功能损害程度更重;Treg细胞的持留与MDR-TB的发生发展密切相关。第二部分肺结核患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞的功能分析方法:采用免疫磁珠法分离TB患者外周血CD4~+CD25~+Treg细胞和CD4~+CD25~-效应性T细胞,采用CFSE法检测CD4~+CD25~+Treg细胞对CD4~+CD25~-效应性T细胞的抑制功能;去除外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞,ELISA法测定BCG刺激下PBMCs中细胞因子IFN-γ的水平。结果:S-TB、MDR-TB患者外周血淋巴细胞来源的CD4~+CD25~+Treg细胞具有免疫调节功能,可有效抑制同源性CD4~+CD25~-效应性T细胞的增殖,且CD4~+CD25~-T细胞的增殖反应随CD4~+CD25~+Treg细胞数量增多而降低;去除实验显示,去除外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞后,BCG刺激下S-TB、MDR-TB患者PBMCs中细胞因子IFN-γ的水平显著增加,表明TB患者的CD4~+CD25~+Treg细胞可有效抑制IFN-γ的生成。结论:CD4~+CD25~+Treg细胞通过抑制Thl细胞增殖,导致Thl细胞因子如IFN-γ分泌的减少,从而削弱机体免疫系统对感染结核分枝杆菌的清除。第三部分肺结核患者外周Treg细胞表面共刺激受体分子CTLA-4、PD-1和ICOS的表达及与疾病关系的探讨方法:采用流式细胞技术检测TB患者和正常对照外周血中Treg细胞表面CTLA-4、PD-1、ICOS分子的表达,比较S-TB患者和MDR-TB患者之间表达的差异,分析其与Treg比率的相关性;免疫磁珠法去除TB患者PBMC中的Treg细胞,应用PD-1功能性抗体拮抗PD-1信号通路,检测分析BCG刺激后PBMC中Treg细胞的比例。结果:肺结核患者外周Treg细胞CTLA-4、PD-1、ICOS的表达显著高于正常对照(p<0.05),且CTLA-4、PD-1的上调在MDR-TB患者较S-TB患者更明显(p<0.05);相关分析显示,CTLA-4、PD-1、ICOS表达与Foxp3的表达正相关(p<0.05);拮抗PD-1信号通路,可显著抑制TB患者BCG诱导的Treg细胞的活化增殖。结论:CTLA-4、PD-1、ICOS分子在TB,尤其是MDR-TB中的重要作用,以及对Treg细胞的调控,使得对相关信号通路的调节有可能成为未来TB治疗的靶标。总结Treg细胞在结核患者特别是MDR-TB患者外周血中的表达明显升高,且具有有效的免疫抑制功能。细胞表面负性共刺激受体分子表达的改变可能促进Treg细胞的增殖。Treg细胞通过对机体免疫力的调节而参与MDR-TB的发生发展,并影响疾病的转归与预后。