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为研究GlnR中与DNA结合的关键氨基酸残基位点，本实验利用生物信息学的方法对无乳链球菌GlnR因子与DNA结合的位点进行预测，筛选出GlnR因子中与DNA结合的3个关键位点的氨基酸残基R27、R30和R47R48。然后将此3个位点的氨基酸残基分别突变，构建出3个glnR突变基因并构建它们的原核表达载体，使它们在大肠杆菌中高效表达。将分离纯化后的3种突变蛋白和GlnR蛋白分别与glnRA操纵子进行结合实验，并观察3种突变基因与glnRA操纵子的结合能力的变化，判断突变位点对DNA结合蛋白的影响，从而确定GlnR-DNA作用的三维结构模型，并初步阐明GlnR与DNA的作用机理。根据以上的内容本文开展以下实验：1、通过基于BindN的网络服务预测无乳链球菌GlnR因子中可能参与DNA结合的氨基酸残基，并通过分析这些氨基酸残基初步筛选最具可能性的结合位点，再利用网络服务器预测的GlnR-DNA三维结构模型来筛选关键位点，结果发现，提交至Zhang Lab的网络服务器预测出两种不同的GlnR-DNA三维结构模型，为确定其结构模型，我们从可能结合的位点中筛选了R27（27位精氨酸）、R30（30位精氨酸）和R47R48（47和48位精氨酸）作为实验的突变位点。2、利用重叠PCR的方法突变此3个氨基酸残基，构建出3个突变glnR基因，根据其在氨基酸序列当中的位置分别命名为glnRm27、glnRm30和glnRm4748（以下以glnRm表示）。DNA测序结果显示成功将R27突变为A27（AGA突变为GCG）、R30突变为A30（CGC突变为GCG）、R47R48突变为A47A48（CGCCGC突变为GCGCGC）。3、成功构建pGEX-4T-glnRm27、pGEX-4T-glnRm30、pGEX-4T-glnRm4748并转化至大肠杆菌BL21中表达。另外，我们对IPTG浓度及诱导温度进行了优化，结果显示IPTG诱导表达的最佳浓度均为0.1mmol/L，最佳诱导温度为30℃，并且可溶性检测显示表达的目的蛋白均为可溶性，最后利用亲和层析柱分离纯化。4、利用电泳凝胶迁移实验（EMSA）分别对上述3种突变蛋白与glnRA基因的体外相互作用进行研究。通过对比未突变GlnR蛋白与glnRA基因的结合情况发现，GlnRm4748几乎完全丧失与glnRA的结合能力，而GlnRm27和GlnRm30虽然与glnRA仍有结合，但结合能力远远弱于未突变的GlnR蛋白。得出结论为：1）、47、48位的氨基酸残基对GlnR结合glnRA起到关键作用，30位氨基酸残基次之；2）、27位也起到一定的影响结合作用，但其对DNA的绑定作用的影响相对较弱；3）、预测的GlnR-DNA三维复合物结构中蛋白与DNA以氢键结合的可能性较小，它们之间的相互作用模式可能为螺旋-转角-螺旋（HTH）模式。