目的：肺炎支原体作为非典型肺炎的病原体,不仅能够引起急、慢性呼吸道感染,还可以引起包括皮肤、关节、中枢神经系统等一系列肺外系统疾病。目前,肺炎支原体的致病机制仍未被阐明。近期,研究者们发现一种名为社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDs TX)蛋白,其被认为是目前为止,肺炎支原体体内单一的毒力因子,在肺炎支原体的致病过程中起到了至关重要的作用。本课题拟构建pET28a-CARDs TX重组质粒,观察其在BL21中表达,并对CARDsTX蛋白进行纯化,利用纯化CARDs TX蛋白免疫动物制备抗血清,并对抗血清的效价和特异性进行检测,探讨其应用价值。方法：一、重组质粒的构建及鉴定：以肺炎支原体基因组为模板,利用PCR技术扩增出带有BamHI和Xhol I酶切位点的CARDs TX基因CMPN372),将其克隆入pET28a,经8次点突变(UGA-UGG)获得pET28a-CARDs TX重组质粒。对重组质粒分别进行酶切与测序鉴定。二、重组质粒的表达及鉴定：将重组质粒转入BL21中,利用IPTG诱导带有pET28a-CARDs TX重组质粒的BL21细菌表达目的蛋白,分别通过SDS-PAGE和Wetern Blot检测CARDs TX蛋白的表达并对目的蛋白可溶性进行鉴定。三、CARDs TX蛋白的纯化及鉴定：利用亲和层析技术(Ni-NTA)对CARDsTX进行纯化,并通过SDS-PAGE和Wetern Blot方法鉴定目的蛋白纯化情况。四、多克隆抗体的制备和鉴定：适应性饲养2只雄性大白兔2周后进行初次免疫,将1ml1mg/ml CARDs TX蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合,于大白兔皮下多点免疫。2周后,每隔1周用1ml1mg/ml蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合,进行多点加强免疫。初次免疫前采取大白兔耳缘静脉血为对照,末次免疫两周后颈动脉取血。利用Western blot方法检测其效价及特异性,ELISA法检测抗血清的应用价值。结果：一、经酶切鉴定发现外源基因、载体及重组质粒均位于正确的大小位置。经测序鉴定,结果发现外源基因碱基序列与Genbank公布的MPN372碱基序列一致,且成功将8个UGA位点突变成UGG。二、对SDS-PAGE和Wetern Blot结果进行分析,我们发现在IPTG的诱导后,在68kDa的位置有蛋白量明显增多。同时也发现该蛋白为不可溶性蛋白。三、利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化并对纯化蛋白进行SDS-PAGE和Wetern Blot分析,结果发现,在68kDa的位置上有特异的目的条带。四、成功制备特异、高效价的重组CARDs TX蛋白多克隆抗体,且在肺炎支原体的检测中有较好的应用价值,为对肺炎支原体的预防、诊断和治疗提供了依据。结论：成功构建出pET28α-CARDs TX重组质粒。经IPTG诱导后,在BL21中CARDs TX蛋白的表达明显增加,并成功将CARDs TX蛋白纯化出来,并成功制备出高效价、特异的多克隆抗体。