论文部分内容阅读
真姬菇（Hypsizygus marmoreus）是一种珍稀食用菌品种,以其丰富的营养价值和广泛的药用价值深受人们的喜爱。真姬菇属于中偏低温型食用菌,温度过高（>25℃）或过低（<5℃）都会对真姬菇的生产造成较大影响。热激蛋白（heat shock protein, HSP）是生物体内最重要的一类逆境诱导蛋白,它们在逆境条件下,尤其是温度胁迫下迅速合成,使细胞免受损伤。HSP具有分子伴侣的功能,参与各种各样的细胞代谢过程,它们还与生物体的抗热、抗冷以及抗氧化性密切相关。因此,热激蛋白基因是育种工作中具有重要实用价值的优良基因。对于热激蛋白的研究国内外主要集中在动物和植物中,关于真菌热激蛋白的研究鲜有报道,目前为止尚未见有关于食用菌热激蛋白的报道。本研究以真姬菇品种白真姬菇为材料,采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）方法,成功克隆出真姬菇HSP基因家族中的一个HSP70基因（HmHSP70）,并在大肠杆菌中进行了异源表达,测定了HmHSP70蛋白的部分功能。获得研究结果如下:1、根据GenBank中异丝绵霉（AKU02504）,光滑假丝酵母（AY077689）,葡枝根霉（AY147869）等的热激蛋白基因保守序列,使用Primer Premier5.0结合DNAMAN6.0程序设计一对简并引物,从真姬菇基因组DNA中扩增出HmHSP70基因部分片段,经PCR鉴定后,将目的片段与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态中,送交上海生工生物工程服务技术有限公司测序。片段长度为690bp,编码230个氨基酸。2、根据测序结果,重新设计引物。Trizol法提取42℃热激处理2h真姬菇菌丝体总RNA,利用PT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆出HmHSP70基因的3’和5’末端。经T载体连接后送交上海生工生物工程服务技术有限公司测序。根据测序结果设计引物扩增HmHSP70基因全长,扩增出2145bp的片段,开放性阅读框（open reading frame, ORF）共2001bp,编码667个氨基酸（GenBank登录号为GQ246176）。3、构建了HmHSP70基因的原核表达载体,使重组质粒pET32a-c（+）/HmHSP70在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示得到蛋白分子量约为92KDa的融合蛋白,与预期结果吻合。大肠杆菌经高温（50℃）热激处理后,通过对大肠杆菌活力的测定和大肠杆菌可溶性蛋白SDS-PAGE电泳检测,结果均表明,HmHSP70蛋白的异源表达可提高大肠杆菌耐高温的能力,对大肠杆菌中其它蛋白有较好的保护作用。4、运用生物信息学的方法,进一步分析真姬菇HmHSP70基因的核酸序列和氨基酸序列。序列分析表明该基因属于HSP70基因家族;氨基酸多序列比对的进化树结果表明,HmHSP70蛋白氨基序列与双色蜡蘑（XP001880175）、新型隐球菌（XP567978）、棒曲霉（XP001275300）、裂殖酵母（XP002172864）的氨基酸序列同源性分别达87%、71%、67%、67%;HmHSP70蛋白分子量为72.2KDa,等电点（PI, isoelectric point）为5.63,不稳定系数为36.67,疏水性分析为可溶性蛋白。本试验研究结果为真姬菇品种的改良、真菌热激蛋白研究及真菌的分子育种奠定了良好的基础。