研究背景目的：骨质疏松(Osteoporosis)是临床常见的骨骼疾病,它以骨密度降低及骨骼结构异常为特征。骨质疏松主要是由于骨形成与骨吸收失衡而导致,破骨细胞的功能异常是其中重要的致病因素。目前,临床上治疗骨质疏松的方法仍以药物治疗为主,最常用的为双膦酸盐、降钙素及雌激素类等降低破骨细胞吸收活性的药物。然而,上述药物都存在一定的毒副作用。因此,明确破骨细胞分化与功能的调控机制为寻找骨质疏松治疗新策略提供了一定的理论基础。骨折是骨质疏松疾病严重的并发症,目前对于骨折最主要的治疗方式为外科手术。但是在外科手术治疗过程中,因各种原因导致的骨不连仍是影响骨折愈合、功能恢复的重要因素。破骨细胞作为行使骨骼吸收功能最主要的细胞,在骨折愈合过程中发挥着吸收凋亡的软骨基质并促进硬骨痂重建的作用。因此,从调控破骨细胞功能角度研究骨折愈合的过程对于骨质疏松患者骨折的预防及治疗有重要的意义。成纤维细胞生长因子及其受体(Fibroblast Growth Factors/Fibroblast Growth Factor Receptors, FGFs/FGFRs)是调控骨骼发育重要的信号分子,主要通过激活MAPK、P13K和PLC-y等信号途径参与调控细胞的增生、分化和凋亡。FGFR3是FGFs/FGFRs家族重要的成员,它在破骨细胞的分化、成熟与功能的调控上扮演重要的角色。研究发现全身FGFR3敲除和功能增强都会导致破骨细胞活性增强,二者结果存在矛盾之处,FGFR3与破骨细胞的直接关系仍不能明确。另外,FGFR3参与骨损伤修复愈合过程的调控,但其具体的调控机制还不是很清楚。而我们推测FGFR3对于骨折的影响在某种程度上是通过调控破骨细胞的功能而实现的。研究目的：本研究针对上述科学问题,通过分析FGFR3条件性基因敲除小鼠骨重建过程中破骨细胞的功能情况以及骨损伤后的愈合情况,旨在明确FGFR3对于破骨细胞的直接调控作用及其分子机制,并阐明FGFR3通过调控破骨细胞功能对骨损伤修复的影响。方法：第一部分：破骨细胞中敲除FGFR3对骨重建的影响及机制研究1.破骨细胞中敲除FGFR3对骨发育的影响1.1对10d、3m及6m龄Fgfr3f/f;LysCre (MUT)小鼠与Fgfr3f/f (WT)小鼠进行身长测量,并通过对幼年小鼠全骨架茜素红/阿尔新蓝染色及成年期X线扫描观察其整体骨骼发育情况；1.2对10d、3m及6m小鼠胫骨标本进行切片染色,观察其生长板是否有异常；1.3Micro CT扫描观察MUT小鼠与WT小鼠第二骨化中心出现时间是否一致。2.破骨细胞中敲除FGFR3对骨重建的影响2.1对10d、3m以及6m小鼠胫骨标本进行切片染色,观察其骨小梁是否有异常；2.2利用MicroCT对成年期小鼠股骨生长板下区域骨小梁进行扫描并重建,观察MUT小鼠骨量是否有变化；2.3对3m小鼠胫骨组织切片进行形态计量,分别统计BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th、Tb.N,对骨量进行评价。3.破骨细胞中敲除FGFR3破骨细胞的影响3.1对3m小鼠石蜡切片N.Oc/B.pm、Oc.S/BS进行计量统计,评价破骨细胞的相关指标；3.2MUT小鼠与WT小鼠骨髓单核细胞体外向破骨细胞诱导培养并进行TRAP染色及计数,观察其体外分化有无异常；3.3体外培养破骨细胞进行鬼笔环肽染色以及扫描电镜观察,对破骨细胞伪足小体进行观察；3.4体外培养成熟破骨细胞总RNA提取,定量PCR法检测破骨细胞相关功能酶TRAP、CTSK、MMP9表达情况；3.5酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TRAP5b水平,对体内破骨细胞功能进行评价；3.6体外破骨细胞与牛骨片共培养,通过测量骨片上骨吸收陷窝面积分析破骨细胞的骨吸收功能是否改变；3.7Western Blot检测破骨细胞FGFR3蛋白表达以及ERK磷酸化水平。4.破骨细胞中敲除FGFR3对成骨细胞的影响4.1酶联免疫吸附法(ELISA) Osteocalcin水平,对成骨细胞的功能进行评价；4.2对3m小鼠硬组织切片N.Ob/B.pm、MS/BS、MAR、BFR进行形态计量,评价成骨细胞功能。第二部分：破骨细胞中敲除FGFR3后对骨骼损伤修复影响的研究1.制备胫骨内固定骨折模型与股骨钻孔损伤模型；2.胫骨内固定骨折手术以及股骨钻孔手术7d、14d及21d后对骨折部位进行X线与MicroCT扫描,观察其损伤修复情况；3.胫骨内固定骨折手术以及股骨钻孔手术7d、14d及21d后标本切片SO/FG、HE染色,在组织学水平观察骨损伤修复部位的愈合情况；4.胫骨内固定骨折手术以及股骨钻孔手术7d、14d及21d后标本TRAP染色观察在骨损伤修复过程中破骨细胞的数量及形态是否改变。结果：第一部分：破骨细胞中敲除FGFR3对骨重建的影响及机制研究1.破骨细胞中敲除FGFR3对骨发育无明显影响。1.1MUT小鼠与WT小鼠身长无明显差异,骨骼无明显异常；1.2幼年期及成年期MUT小鼠胫骨生长板与WT小鼠无明显差异；1.3MicroCT显示MUT小鼠第二骨化中心出现时间与WT小鼠无明显差异。2.破骨细胞中敲除FGFR3后骨量增多。2.1对幼年期以及成年期小鼠胫骨标本染色,初步发现MUT小鼠与WT小鼠相比骨量明显增多；2.2MicroCT扫描结果显示：3m龄MUT小鼠较WT小鼠骨小梁数量及厚度增加,其骨小梁分离度降低,同时骨小梁连接密度也增高,其骨量明显增高；2.3形态计量学显示,MUT小鼠较WT小鼠骨量明显增多。3.条件性敲除FGFR3后破骨细胞骨吸收功能降低3.1MUT小鼠与WT小鼠在组织切片水平破骨细胞数量、大小无明显差异；3.2MUT小鼠与WT小鼠体外分化水平破骨细胞形态及分化均无明显差异；3.3体外培养破骨细胞并对成熟破骨细胞进行鬼笔环肽染色,发现MUT小鼠与WT小鼠破骨细胞伪足小体形成无异常,扫描电镜观察MUT组破骨细胞粘附良好；3.4MUT小鼠体外诱导破骨细胞TRAP、CTSK以及MMP9与WT小鼠相比,其转录水平表达明显降低；3.5ELISA检测MUT小鼠血清中TRAP5b较WT小鼠明显降低；3.6MUT小鼠破骨细胞体外吸收骨片形成吸收陷窝面积较WT组也显著减小；3.7Western Blot检测发现MUT小鼠FGFR3蛋白表达明显降低,同时ERK磷酸化水平也降低。利用FGF2处理后MUT小鼠ERK磷酸化水平增高,同时其CTSK、 TRAP、MMP9相关酶RNA转录也明显提高,骨片吸收面积也较未处理组显著增加,但仍低于WT组。4.破骨细胞中敲除FGFR3后对成骨细胞无明显影响4.1ELISA检测MUT小鼠血清中Osteocalcin较WT小鼠无明显变化；4.2形态计量学分析发现MUT小鼠与WT对照小鼠在成骨细胞数量、面积、骨形成速率、骨矿化沉积率及骨矿化表面积均无明显改变。第二部分：破骨细胞敲除FGFR3对骨骼损伤修复影响的研究1.破骨细胞敲除FGFR3后导致胫骨内固定骨折愈合延迟。1.1X线扫描骨折手术21d可见WT组愈合良好,骨折线不明显,而MUT组骨折’线仍较明显,周围骨痂量明显多于WT组；1.2MircoCT扫描发现骨折7d后两组间没有显著差异,14d后MUT小鼠硬骨痂量明显少于WT组小鼠,21d时WT组小鼠可见重塑的板状硬骨痂,而MUT小鼠硬骨痂多为小梁骨；1.3SO/FG染色结果显示7d两组无明显差异,骨折后14d,MUT小鼠残余软骨痂面积明显较多,骨折后21d, MUT、鼠的骨折断端周围仍可见少量残留软骨骨痂存在,且硬骨痂重塑延迟；1.4TRAP染色发现两组小鼠7d时均无成熟破骨细胞,而在14d及21d可见破骨细胞附着于硬骨痂骨小梁的表面,但数量无明显差异。2.破骨细胞敲除FGFR3不影响股骨钻孔损伤的骨皮质再生,但新生小梁状骨痂吸收减慢2.1X线扫描结果发现两组小鼠骨皮质缺损均在21d时愈合；2.2MicroCT扫描并重建发现14d时两组小鼠股骨损伤区域均可见新生骨小梁并且在靠近骨外膜部位有少量新生的板层骨结构,21d时缺损区域形成完整的与周围正常骨皮质连接的新生骨；2.3HE染色发现7d时MUT组与WT组在股骨缺损区域均有大量间充质组织聚集；14d时可见MUT组与WT组损伤区域有骨小梁形成,且MUT组较WT组多,靠近骨外膜区域可见新生骨皮质；21d可见MUT组骨髓腔中残留骨小梁较WT组多,缺损区域均愈合良好；2.4TRAP染色发现术后7d两组均无典型破骨细胞形成；14d与21d时破骨细胞主要集中在新生骨小梁表面,且两组间无明显差异,在新生皮质骨区域未见破骨细胞。结论：1.破骨细胞中FGFR3功能缺失不影响小鼠骨骼发育,但长骨骨量增多；2.条件性敲除FGFR3后破骨细胞分化及形态无明显异常,但骨吸收功能降低,3.FGFR3通过下游ERK信号通路介导了FGF2对于破骨细胞的调控作用；4.破骨细胞敲除FGFR3后,成骨细胞功能无明显改变；5.破骨细胞敲除FGFR3后,骨骼损伤愈合减慢。