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迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一类感染宿主范围广泛的革兰氏阴性致病菌,引起鱼类的爱德华氏菌病,对水产养殖业造成严重经济损失。Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)是细菌重要的毒力因子分泌系统,细菌通过Ⅲ型分泌系统将毒力蛋白直接输入宿主细胞,干扰正常的细胞活动,促进细菌在细胞内复制和繁殖。本研究以迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统调控蛋白EsaB/EsaL/EsaM为研究对象,围绕EsaL如何控制Ⅲ型分泌系统底物分泌展开研究,为阐明迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统的分子致病机理及研制弱毒疫苗奠定基础。研究发现EsaL不是Ⅲ型分泌系统的分泌蛋白,其主要分布于细菌膜相。esaL缺失后,输送器蛋白EseB/EseC/EseD分泌显著减少,说明EsaL促进输送器蛋白分泌。改变环境条件,如Ca2+浓度和pH,不影响EsaL对输送器蛋白分泌的促进作用。然而,EsaL对效应分子分泌的控制作用随环境因子改变而变化:当Ca2+浓度增高或降低时,EsaL不影响效应分子的分泌;当pH为酸性条件时,EsaL促进效应分子分泌,中性条件下则不影响效应分子的分泌。报道显示,EsaL同源蛋白,如Salmonella SsaL、EPEC/EHEC SepL和Yersinia YopN,均与各自的Ⅲ型分泌系统的另外两个蛋白形成复合物(即SpiC/SsaL/SsaM、SepD/SepL/CesL和YscB/YopN/SycN),从而控制Ⅲ型分泌系统的蛋白分泌,细菌缺失这些相互作用的蛋白通常具有相似的胞外分泌表型。通过序列分析,发现EsaB和EsaM可能是迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统中EsaL的互作蛋白,且ΔesaB和ΔesaM的输送器蛋白分泌亦明显减少,表明EsaB和EsaM也可促进输送器蛋白分泌。利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术,进一步确定了EsaL、EsaB和EsaM三者的相互作用关系:EsaL能单独与Esa B或EsaM互作,esaB或esaM缺失不影响EsaL与另一个蛋白相互作用;EsaB和EsaM之间也存在相互作用,而这种互作不依赖EsaL。与EsaL一样,EsaB和EsaM也是胞内蛋白。由于esaB或esaM缺失后,胞内EsaM或EsaB总量降低,表明两者可能互相稳定。蛋白稳定性实验证实了这一推测:esaB或esaM缺失,胞内EsaM和EsaB的总量随时间变化减少,EsaM对EsaB的稳定作用尤为显著,但胞内EsaL含量不随时间变化而减少,表明Esa B和EsaM不具有稳定EsaL的作用。当细菌在酸性pH生长时,EsaL、EsaB和EsaM均能促进效应分子分泌;pH由酸性向中性变化时,ΔesaL胞外EseG分泌量增加,而ΔesaB和Δesa M胞外EseG分泌持续受到抑制,说明Esa L在酸性条件下促进效应分子分泌,而中性时抑制效应分子分泌;EsaB和EsaM在酸性及中性条件下均促进效应分子的分泌。此外,在中性pH条件下培养迟缓爱德华氏菌,再更换培养基使其pH为酸性或中性时,EsaL能感受pH变化,促进效应分子分泌,EsaL控制效应分子分泌随培养条件变化而不同。CyaA转导实验表明esaL缺失不影响效应分子进入宿主细胞的效率;测定野生型(WT)和ΔesaL感染细胞后培养上清乳酸脱氢酶水平,发现两者无明显差异,说明esaL不参与E.tarda引起的细胞毒性。而esaB和esaM缺失后效应分子进入宿主细胞的量显著低于WT。对于鱼类感染实验,esaL缺失后迟缓爱德华氏菌半数致死量LD50(median lethal dose)上升3.39倍,7 d后蓝曼龙的存活率为97.22%;ΔesaB和ΔesaM感染后存活率为97.22%和100%,而此时WT感染组蓝曼龙存活率只有30.55%。竞争感染实验表明ΔesaL、ΔesaB和ΔesaM的竞争感染指数分别为0.17±0.05、0.12±0.03和0.05±0.03,三者均极显著小于1(P<0.001),表明esaL、esaB和esaM缺失后,细菌毒力显著降低。这些体内实验表明esaL、esaB和esaM能通过控制输送器蛋白以及效应分子的分泌及转运,在迟缓爱德华氏菌的致病过程中发挥作用。此外,通过酵母双杂交,发现EsaK和EsaE均与EsaL有强的相互作用,esaK和esaE缺失后,胞内EsaL总量减少,具体机理尚待进一步研究。