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心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是目前全球范围内死亡率最高的疾病之一。研究阐明了血液中低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的高低可以单独调控心血管疾病的发生。因此,保持低水平的LDL-C可以控制高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病等与血脂关联的心血管疾病。2003年,PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9)突变基因首次被发现,与熟知的LDLR和ApoB同属于常染色体显性基因,关联家族性高胆固醇血症。此后,PCSK9的突变体及其生物学功能被逐步发现和阐明。PCSK9属于分泌型丝氨酸蛋白酶,成熟的PCSK9进入血液后与低密度脂蛋白胆固醇受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)结合,将LDLR一起转运至肝细胞溶酶体直接降解,减少PCSK9循环使用的次数。LDLR主要负责转运血浆中的低密度脂蛋白(LDL)至溶酶体降解,因此LDL-C水平与PCSK9高低呈正相关。体外实验结合PCSK9基因缺陷小鼠体内实验显示PCSK9能够调节LDLR的表达水平。总之,PCSK9抑制剂可实现对高血脂的有效控制,并通过调节LDL-C的水平防治心血管疾病。单克隆抗体是目前生物类药物的主要研究方向,尤其是全人源单克隆抗体的研发。Harbour转基因小鼠的抗体基因由人的可变区,大鼠的恒定区以及小鼠的位点控制区和增强子组成,经人PCSK9免疫后可以得到含人可变区的抗PCSK9单克隆抗体,该单克隆抗体从小鼠体内直接产生,拥有正常的装配和成熟路径,因此较鼠源抗体以及鼠源抗体改造的嵌合抗体具有更高的亲和性。以人PCSK9蛋白和表达人PCSK9的质粒作为免疫原,采用蛋白与弗氏佐剂、蛋白与Gerbu佐剂以及质粒与基因枪组合的三种免疫方案对Harbour转基因小鼠进行免疫,4次或者5次免疫后,血清滴度用ELISA分析可达1:10000。取Harbour小鼠脾细胞和淋巴结与SP2/0进行PEG融合或者电融合,通过蛋白水平上抗原抗体结合实验(SA包被ELISA)、配体结合阻断实验和细胞水平上的PCSK9介导的HepG2细胞表面LDLR下调实验、PCSK9介导的LDL内摄实验的层层筛选,最终拿到2株符合各项要求的阳性单克隆,命名为96F8C10和139G1C5,利用亚型测定试剂盒测得2株克隆的亚型分别为IgG1和IgG2b。用蛋白G亲和层析法得到纯化抗体,命名为mAb016(139G1C5)和mAb023(96F8C10)。SEC-HPLC法和SDS-PAGE法测得该抗体的纯度均>90%。经抗原抗体结合活性实验和生物学功能实验证实两株单抗与PCSK9具有良好的结合能力,均能够较好的抑制PCSK9介导的LDLR表达下调和增加LDL的内摄。本研究成功制备了两株靶向明确,亲和力高,生物学功能显著的抗PCSK9单克隆抗体,为后续的全人源单克隆抗体的研制奠定了坚实的基础。