[目的]肿瘤细胞的侵袭转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征之一,也是临床恶性肿瘤患者死亡的首要因素。但是,肿瘤发生转移的机制尚不十分清楚。传统细胞融合理论认为肿瘤细胞和白细胞相互融合形成转移细胞,肿瘤细胞从而被赋予了白细胞的移行能力。近年来研究证明,白细胞释放的微颗粒作为一种新的信息传递物质与肿瘤细胞的相互融合参与了肿瘤细胞的转移机制。另外,肿瘤细胞在继发部位形成转移瘤与白细胞募集到炎症部位的过程都需要黏附分子所介导的细胞和内皮细胞间黏附作用。白细胞整合素亚家族成员,如αLβ2和αMβ2是参与白细胞黏附的重要分子,肝癌细胞能否利用这些黏附分子介导其转移的发生尚不清楚。本研究检测了免疫细胞产生的微颗粒及其携带的黏附分子表型在肝癌细胞表达,进一步通过细胞和动物模型探索了肝癌细胞通过微颗粒途径获得黏附分子并介导其侵袭和转移的作用。[方法]1.免疫细胞微颗粒的制备和检测BALB/c来源的脾细胞用50 ng/ml PMA刺激12 h后将脾细胞悬液超速20000 g×60 min离心所得沉淀洗1次后重悬至PBS缓冲液,流式细胞术和双光子共聚焦显微镜成像技术检测微颗粒的大小和数量。2.微颗粒和负载微颗粒的肝癌细胞表面免疫分子的检测将微颗粒悬液和肿瘤细胞共孵育20 h后PBS缓冲液轻柔洗2次,所得沉淀即是融合有微颗粒的肿瘤细胞。将微颗粒和负载微颗粒的H22融合细胞分别用荧光抗体4℃染色30 min,PBS缓冲液洗3次离心后将微颗粒和细胞沉淀分别加入300μl PBS缓冲液重悬,行流式细胞术检测和分析。3.趋化实验趋化实验采用8-μm孔径的24孔Trans-well板进行。将25μ1配制好的基底胶(5μg in 10μl serum-free RPMI 1640)滴入孔板上室,使其完全覆盖上室底部形成薄膜并置于37℃温箱孵育过夜。小室上层加入200μ1细胞悬液,下层加入600μl含20% FBS的RPMI 1640细胞培养基。Trans-well板在37℃,5% CO2培养箱中孵育20 h后,对趋化的细胞染色并显微镜下计数。4.动物实验本实验所选择的动物为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。将不同处理组的微颗粒分别和H22细胞共同孵育20 h制备融合细胞,取一等份融合H22细胞加入20μg/ml抗CD18或CDllb中和性抗体,继续孵育4h阻断CD18或CD11b的表达,封闭后细胞沉淀重悬于0.9%的生理盐水中备用。每只小鼠尾静脉注射3×105H22细胞,封闭组小鼠注射细胞4h后按照30μg/只补充注射CD18或CD11b中和性抗体1次,各组小鼠饲养70天左右并观察成瘤情况。[结果]1.PMA活化的免疫细胞释放微颗粒采用50 ng/ml的PMA刺激BALB/c小鼠脾脏来源的免疫细胞12h后取细胞培养上清低温超速离心获得沉淀并重悬于PBS缓冲液中,流式细胞术检测微颗粒的大小和数量。结果显示免疫细胞经过PMA刺激活化后可释放微颗粒,且PMA活化细胞释放的微颗粒约为未活化细胞释放微颗粒的6倍。双光子共聚焦显微镜成像技术观测微颗粒的直径均小于1μm。2.免疫细胞产生的微颗粒表型的表达对微颗粒进行免疫细胞特异性标志物的荧光抗体染色。流式细胞术检测结果示PMA处理组的微颗粒,其CD3和CD19分子的表达轻微增加,而Gr-1和F4/80分子的表达增加较为显著。提示微颗粒携带有其母细胞来源的多种表型分子,且相对于T细胞或B细胞而言,在PMA刺激下以髓性细胞产生的微颗粒为主。3.肝癌细胞可摄取免疫细胞产生的微颗粒并表达其表型将微颗粒和H22细胞共同孵育20 h后行H22细胞的免疫学标志物流式细胞术检测。结果显示H22细胞表面不同程度的表达微颗粒来源的免疫表型,如CD19、Gr-1 F4/80、CD3和MHC-II分子。提示免疫细胞通过微颗粒途径可将其免疫学表型转移至肿瘤细胞,从而赋予肿瘤细胞新的免疫表型。4.免疫细胞活化产生的微颗粒对H22细胞趋化性的影响为了探索肿瘤细胞在获得新表型后生物学功能的改变,采用趋化实验检测H22细胞的能动性和侵袭转移能力。结果可见control-MP-H22组迁移至下室的细胞数较未处理组有少量增加,而PMA-MP-H22组迁移至下室的细胞数较control-MP-H22组显著增加。为了进一步证明H22细胞在获得免疫细胞来源的表型后其在小鼠体内的生物学功能,我们设计了BALB/c小鼠体内检测模型。各组小鼠尾静脉注射细胞后持续观察70天左右,期间发现PMA-MP-H22细胞注射组的小鼠在躯体不同部位长出肿瘤,继而死亡。control-MP-H22组有1只小鼠长出肿瘤,而未处理H22细胞组小鼠未发现肿瘤生长,并且PMA-MP-H22细胞组小鼠生存期明显短于未处理H22细胞组小鼠。5. CD11b/CD18通过微颗粒途径介导H22细胞的侵袭和转移将负载有微颗粒的肿瘤细胞和中和性CD11b或CD18抗体分别孵育检测肿瘤细胞的侵袭转移能力。趋化实验结果可见阻断CD11b或CD18的表达后,H22细胞的侵袭转移能力较阻断前明显减弱。各组小鼠尾静脉注射细胞后持续观察70天左右。结果发现PMA-MP-H22细胞注射组小鼠在不同时间段分别长出肿瘤,且部位随机,而未处理H22细胞注射组小鼠未发现有肿瘤生长。另外,CDllb或CD18分子阻断组小鼠分别有1只和2只小鼠长出肿瘤。各处理组小鼠生存曲线可见PMA-MP-H22细胞组小鼠生存期明显短于未处理H22细胞组。而CD1lb或CD18分子阻断组小鼠生存期较之PMA-MP-H22细胞注射组有所延长。以上结果说明,H22细胞经过PMA-MP处理后,其侵袭转移能力明显增强,而当阻断黏附分子CD11b或CD18的表达后,其侵袭转移能力则明显减弱。6.天然免疫细胞来源的微颗粒对H22细胞侵袭和转移的影响为了证明免疫细胞的哪一亚群产生的微颗粒促进肝癌细胞的侵袭和转移,将BALB/c小鼠脾脏的免疫细胞进行磁珠分选后获得T细胞、B细胞和不含有T、B细胞(天然免疫细胞)的三组细胞,将各组细胞PMA刺激活化12 h和H22细胞共孵育20 h后分别加入Trans-well孔板上室,计数移动至下室的细胞。趋化实验结果显示B-MP和T-MP处理组迁移至下室的细胞较未处理稍有增加,而innate-MP处理组迁移至下室的细胞较未处理组显著增加,提示天然免疫细胞产生的微颗粒在促进H22细胞的侵袭转移中可能发挥重要作用。7.TIL产生的微颗粒对肝癌细胞侵袭和转移的影响采用冻融上清刺激TIL活化产生微颗粒,流式细胞术检测结果示FTS活化刺激TIL后产生的微颗粒,其CD11b/CD18分子的表达较未刺激组不同程度的增加。进一步将微颗粒和H22细胞共同孵育20 h,流式细胞术检测结果示H22细胞表面不同程度的表达微颗粒所携带的整合素分子CDllb/CD18。采用趋化实验检测H22细胞的侵袭转移能力结果可见,rest TIL-MP组迁移至下室的细胞较未处理组有少量增加,FTS-TIL-MP组迁移至下室的细胞较rest TIL-MP组增加。当阻断CDllb或CD18分子的表达后,H22细胞的侵袭转移能力较阻断前明显减弱。最后,设计BALB/c小鼠体内检测模型进一步证明,各组小鼠尾静脉注射细胞后持续观察70天左右,发现FTS-TIL-MP组小鼠在不同时间段躯体不同部位长出肿瘤,继而死亡,rest TIL-MP组和未处理H22细胞组小鼠则未发现肿瘤生长,CDllb或CD18分子阻断组分别有1只和3只小鼠长出肿瘤。观测各组小鼠的生存期结果显示FTS-MP-H22注射组小鼠生存期明显短于未处理H22细胞注射组小鼠,而CDllb或CD18阻断组小鼠生存期较之FTS-MP-H22注射组小鼠生存期有所延长。以上结果说明,H22细胞经过FTS-TIL-MP处理后,其侵袭转移能力增强,而当阻断整合素CDllb或CD18分子的表达后,其侵袭转移能力减弱。[结论]本课题研究证明免疫细胞来源的微颗粒可以被肿瘤细胞所摄取,使肿瘤细胞获得免疫细胞的生物学特性,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。趋化实验和体内封闭实验证实整合素CD11b/CD18分子在微颗粒途径介导H22细胞侵袭和转移中起一定作用,微颗粒通过转运整合素CD11b/CD18分子至H22细胞可促进其侵袭转移。进一步通过趋化实验和动物实验发现TIL活化后产生的微颗粒亦具有促进肝癌细胞侵袭和转移的能力,而当阻断整合素CD11b或CD18分子的表达后,H22细胞的侵袭转移能力较阻断前减弱。以上研究结果表明肿瘤浸润白细胞活化产生的微颗粒通过转运整合素CD11b/CD18(αMβ2)>可促进H22细胞侵袭和转移。