研究背景和目的叶酸是人体必需的B族水溶性维生素,其不同的辅酶形式在一碳单位代谢过程中发挥重要作用,是嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶合成及同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸时再甲基化过程中不可或缺的物质。同型半胱氨酸是甲硫氨酸循环和半胱氨酸代谢的重要中间产物,主要经转硫化、再甲基化过程代谢,需叶酸、维生素B12、维生素B6参与。叶酸是同型半胱氨酸代谢过程中重要的辅助因子,叶酸水平的升高可促进同型半胱氨酸再甲基化过程的进行。饮食中叶酸缺乏、一碳单位代谢障碍等原因均可导致同型半胱氨酸循环受阻,不能正常代谢,引起同型半胱氨酸堆积,当空腹血浆同型半胱氨酸浓度>15μmol/L则产生高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症与某些神经精神疾病之间存在密切的联系。有研究表明,高同型半胱氨酸可能具有神经毒性,老年人同型半胱氨酸水平越高,大脑萎缩的可能性越大。在与相关疾病的研究中发现,帕金森氏症患者同时伴有高同型半胱氨酸血症,在对抑郁症患者的研究中也发现有一半的患者同型半胱氨酸水平高于正常,且同型半胱氨酸水平较高的患者汉密尔顿抑郁等级评定的得分也较高。高同型半胱氨酸血症损伤血管内皮细胞已被确立为心脑血管疾病独立危险因素,国内外有关叶酸、同型半胱氨酸与抑郁症发病相关性的流行病学调查报道较多,但结果不尽一致。有研究认为低叶酸与抑郁症的发生具有相关性,叶酸缺乏是抑郁症的危险因素,但也有报道称同型半胱氨酸与抑郁症相关,且同型半胱氨酸浓度每升高1μmol/L,发生抑郁症的风险将增加2%-5%。抑郁症是危害人类健康的主要疾病之一,病因复杂,对其病因机制的探讨是达到疾病预防及有效治疗的必要途径。目前对抑郁症发病机制研究的热点集中在神经回路、单胺类神经递质、神经内分泌与神经免疫功能、遗传因素与表观遗传学机制、神经营养因子与神经发生、细胞因子假说等,而叶酸缺乏、高同型半胱氨酸与抑郁症发病的机制尚无定论,目前有几种可能机制：同型半胱氨酸的神经毒性作用、氧化应激损伤及叶酸抗氧化性及叶酸缺乏导致一碳单位代谢障碍影响神经递质合成等机制相关。同型半胱氨酸的神经毒性作用机制尚未完全明确,目前认为主要与N-甲基-D天冬氨酸受体过度激活和氧化应激相关。N-甲基-D天冬氨酸受体是与Ca2+通道偶联的离子型兴奋性氨基酸受体,可与谷氨酸样受体激动剂-N-甲基-D天冬氨酸的特异性结合。海马中存在大量谷氨酸能神经元,同型半胱氨酸是内源性的谷氨酸能受体激动剂,它与N-甲基-D天冬氨酸受体有很高的亲和力。同型半胱氨酸能激活促离子型和促代谢型谷氨酸受体,引起大量的钙离子内流致使钙超载,损伤线粒体及激活蛋白酶核酸酶、磷酸酯酶、一氧化氮合成酶等,从而导致细胞代谢障碍结构及功能受损,导致神经元功能失调,抑制神经元的网络活性。海马中含有大量谷氨酸能神经元,同型半胱氨酸过度激活N-甲基-D天冬氨酸受体,则易使海马区神经元受损。氧化应激是活性氧片段和抗氧化防御系统严重失衡所致的活性氧片段产物增多及抗氧化物质减少的病理生理过程,与神经变性疾病并发症的发生密切相关。研究表明氧化应激是同型半胱氨酸造成神经细胞损伤的重要的发病机制之一,同型半胱氨酸分子之间可以相互氧化,也可以同其它含自由巯基的氨基酸或蛋白质结合形成二硫化物复合物,产生过氧化氢和超氧阴离子,使氧化还原反应失衡,影响血管和神经元的氧化还原反应信号转导机制。超氧化物歧化酶是一种金属蛋白酶,在体内是重要的内生性氧自由基清除剂,其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。同型半胱氨酸能够抑制超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶等抗氧化酶的活性,减少活性氧片段的清除,导致活性氧片段在细胞内和线粒体内聚,启动血液循环中的、细胞膜及线粒体膜上的脂质过氧化反应,使线粒体膜和细胞膜稳定性下降,通透性增加,钙稳态调节失衡,导致细胞破坏。叶酸是一种有效的抗氧化剂,可清除氧过氧化氢和超氧阴离子等自由基团,维持中枢神经系统的稳定性,抑制脑细胞过度凋亡和DNA大量破坏。叶酸缺乏可导致细胞内抗氧化防御系统失衡,增加氧化应激和细胞凋亡事件的发生,并可能影响中枢神经系统功能并出现神经病变、行为异常及认知功能障碍。实验表明补充叶酸可增强老年大鼠脑组织的抗氧化能力,使超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性增高,谷胱甘肽含量上升,降低脂质过氧化物水平,减少氧化应激对神经元的损伤。叶酸在一碳单位代谢过程中发挥重要作用,叶酸缺乏使一碳单位代谢受损,同型半胱氨酸水平升高,可能加重同型半胱氨酸的神经毒性。脑源性神经营养因子是神经营养因子家族中重要成员之一,具有神经保护作用,广泛分布于哺乳动物脑组织中,对中枢及外周神经系统的发育、稳定性的维持发挥重要作用。在中枢神经系统,脑源性神经营养因子主要在神经元内合成,顺行性轴浆运输至轴突末梢,释放后通过特异性受体作用于靶组织发挥作用。此外,脑源性神经营养因子也可由神经元的靶细胞分泌,反向营养神经元,对神经细胞的生长发育和保护修复起到十分重要的作用。脑源性神经营养因子由神经元以功能依赖性的方式释放,对神经细胞的生长发育和保护修复起到重要作用,免疫组化证实,脑源性神经营养因子免疫阳性神经元广泛分布在大鼠脑内,以海马齿状回和皮层的含量为最高,已有研究表明高同型半胱氨酸会降低大鼠海马区脑源性神经营养因子的含量,从而导致大鼠记忆功能受损及行为学改变,但报道较少,机制尚不明确。人体自身不能合成叶酸,需经饮食或药物补充,叶酸缺乏又是导致高同型半胱氨酸血症的常见原因,故本文旨在通过叶酸缺乏饲料建立大鼠高同型半胱氨酸血症模型,观察叶酸缺乏伴高同型半胱氨酸血症引起大鼠行为学、海马区神经元病理学以及对大鼠海马脑源性神经营养因子及血清超氧化物歧化酶水平的影响,并通过研究高同型半胱氨酸血症大鼠神经精神系统及行为学的改变,初步探讨其可能机制,以期为抑郁症的发生机制及防治思路提供启示。方法健康雄性SD大鼠28只,适应性喂养1周后分为2组：叶酸缺乏组18只,对照组10只。叶酸缺乏组喂食“叶酸含量为Omg/kg饲料”,对照组喂食叶酸含量为1.6mg/kg的普通饲料,饲养时间6周,建立叶酸缺乏、高同型半胱氨酸血症大鼠模型。每周监测大鼠体重变化,并观察大鼠活动量、皮毛光洁度等一般状态改变。实验前后测定血清叶酸、同型半胱氨酸、超氧化物歧化酶浓度,实验6周后,旷场试验监测行为学改变,叶酸缺乏组、对照组分别取大鼠8只、5只,麻醉后开胸经心腔用生理盐水及4%多聚甲醛灌注后取脑,分离海马,10%福尔马林固定后石蜡切片,行HE染色观察大鼠海马区神经元改变,余大鼠直接麻醉后处死冰上迅速取海马组织并测定海马区BDNF含量变化。统计学处理：应用SPSS16.0统计学软件检验,计量资料以均数±标准差表示,两组计量资料组间比较采用两独立样本的t检验,重复测量数据组间比较采用重复测量方差分析法,P<0.05为有统计学差异。结果随着饲养时间的延长,对照组大鼠皮毛光亮整洁,叶酸缺乏组大鼠色泽稍逊于对照组,且喜扎堆。2组大鼠体重均有增加,6周时与对照组比较,叶酸缺乏组大鼠体重显著低于对照组,有显著性差异(P<0.05)。6周饲养后,行为学测试中旷场试验水平运动及粪便粒数2项指标,叶酸缺乏组与对照组相比,均有统计学差异(P<0.05),垂直运动两组无显著性差异(P=0.87)。实验初始时2组大鼠血清叶酸、同型半管氨酸浓度无明显差异,6周后叶酸缺乏组叶酸浓度显著低于对照组(P<0.01),叶酸缺乏组大鼠血清同型半胱氨酸浓度高于本组实验开始时浓度(P<0.01)。按照不同处理组分析,两种饲料对大鼠血清同型半胱氨酸浓度的影响有显著性差异(P<0.01)。叶酸缺乏组超氧化物歧化酶呈增高趋势,第0周与第6周(P<0.01)、第4周与第6周(P<0.01)、第4周与第6周(P<0.01)比较,差异具有统计学意义。实验6周后叶酸缺乏组海马脑源性神经营养因子含量低于对照组(P<0.05)。海马病理学显示,对照组海马CA1、CA3区的神经元结构完整,排列整齐,形态正常,叶酸缺乏组大鼠海马CA3区神经元排列较疏松,可见部分细胞缺失,出现空隙,部分胞体收缩呈圆形椭圆形,胞浆浓染,胞核固缩,上述表现在海马CA3区尤为明显。结论1、叶酸缺乏饮食可导致大鼠出现类似抑郁症的行为学改变。2、通过叶酸缺乏饮食建立了大鼠高同型半胱氨酸血症模型,大鼠血清叶酸浓度逐渐降低、同型半胱氨酸浓度的逐渐升高,最终出现高同型半胱氨酸血症,同时超氧化物歧化酶浓度升高。3、大鼠海马组织发生病理学变化,表现为神经元细胞缺失,部分胞体收缩呈圆形/椭圆形,胞浆浓染,胞核固缩,且在海马CA3区尤为明显,可能与叶酸缺乏所致高同型半胱氨酸血症导致。4、大鼠海马区脑源性神经营养因子含量减低可能与叶酸缺乏所致高同型半胱氨酸血症相关。