论文部分内容阅读
日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是一种发生在亚洲的蚊媒疾病,由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起。JEV通过水禽、猪、库蚊之间的循环而维持在自然界中,也可以通过蚊子将病毒传染给人类。近年来,传统的单克隆抗体已经用于多种疫病的研究,除此之外,单链抗体也越来越多被用于实验室。单链抗体是一种基因工程抗体,通过基因工程获得的单链抗体相对于免疫试验动物获得的单克隆抗体而言,表现出了很多优点:首先,其分子量小,穿透力强,可以快速、高效地到达靶组织;其次,不具有恒定区Fc片段,所以不会与非靶细胞上的Fc受体结合,特异性更强;除此之外,表达形式更加多样,可以采用原核表达系统、真核表达系统、和植物表达系统等多种表达系统进行表达,生产成本更低、且制备周期短。鉴于此,本研究采用大肠杆菌表达系统研制JEV NS1’单链抗体,应用于NS1’蛋白的检测与功能的研究。相比于大肠杆菌表达系统容易形成不溶性包涵体的特性,Bac-to-Bac杆状病毒表达系统所制备的蛋白能够保持蛋白的天然结构,是制备单链抗体较好的选择,因此本研究在sf9细胞中表达了一种具有黄病毒交叉反应性的E蛋白单链抗体,并将两种不同表达系统所制备的单链抗体进行比较,具体研究内容如下:1.日本脑炎病毒NS1’蛋白单链抗体的原核表达与鉴定从实验室保存的分泌JEV核糖体移码蛋白NS1’蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（M-3和M-5）中提取总RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物,扩增NS1’单克隆抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。在VH上游和VL下游引物的5’端分别加入EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位点的基因序列,VH下游和VL上游引物的5’端分别加入连接肽（Linker）基因序列,通过SOE-PCR连接VH和VL。将连接后的产物双酶切后构建到原核表达载体pET-28a（+）中,阳性重组质粒转化BL21细菌,用IPTG诱导其表达,表达产物超声破碎后经镍亲和层析柱进行纯化。结果表明:获得的JEV核糖体移码蛋白NS1’单链抗体的相对分子质量为33 kDa,Western-blotting检测时能够和HRP偶联抗小鼠His标签单克隆抗体特异性反应。激光共聚焦显微镜分析表明该单链抗体能够识别细胞中的JEV抗原。因此本研究成功制备了 JEV核糖体移码蛋白NS1’单链抗体,为源于单个B细胞的JEV重组抗体的筛选提供了一定的试验基础。2.日本脑炎病毒E蛋白单链抗体在杆状病毒系统中的表达与鉴定单克隆抗体6B6C-1已经被证实具有广泛的黄病毒交叉反应性,且其重链可变区、轻链可变区基因序列在NCBI（FJ234928.1、FJ234927.1）上进行了公布。本研究据此合成含有His标签的黄病毒E蛋白交叉反应性单克隆抗体6B6C-1对应的单链抗体基因,将此单链抗体基因克隆至pFastBacDual,构建重组载体pFastBacDual-scFv-E,转座大肠杆菌感受态细胞DH10Bac,获得重组Bacmid,将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9,72h后对转染的Sf9细胞进行离心、收集上清液,获得具感染力的重组病毒,用于侵染新培养的Sf9细胞。经过三代培养后,收集细胞,超声破碎后利用镍亲和柱纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色及Western-blotting鉴定。结果表明:成功构建了pFastBacDual-scFv-E重组载体,获得的重组Bacmid转染sf9细胞后,细胞中能够表达E蛋白单链抗体,且P1、P2、P3代杆状病毒都具有侵染性,纯化后的单链抗体纯度高,其浓度为0.1 mg/mL。Western-blotting结果表明:该单链抗体能够和HRP偶联抗小鼠His标签单克隆抗体特异性反应,也能特异性识别纯化后的JEV疫苗株SA14-14-2以及转染BHK-21细胞产生的prME蛋白。本研究制备了具有JEV结合活性的6B6C-1单链抗体,为进一步探究其体外中和活性、以及在体内通过血脑屏障中和中枢神经系统中的JEV,达到治疗JE的效果奠定了基础。