溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是海水养殖动物如鱼、虾、贝类等的致病菌可引起多种海水养殖动物及人类发病，研制相关疫苗，开展免疫防治是预防该类疾病的重要手段。目前研究表明,热修饰性蛋白（Heat‐modifiable protein）是一类保守性较高,免疫原性良好的细菌外膜蛋白,是一种潜在的细菌病疫苗候选材料,所以本研究以此为切入点，对溶藻弧菌热修饰性蛋白进行筛选鉴定。根据热修饰性蛋白在不同温度下具有不同电泳迁移性的特性，本论文对提纯的一株大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白进行热处理，并结合电泳及免疫学手段，筛选、鉴定出了溶藻弧菌外膜蛋白中的一个分子量为30kDa的具热修饰特征的蛋白，比较分析其抗原保守性及在各溶藻弧菌内的分布情况，进而以双向电泳结合质谱鉴定技术对30kDa的蛋白种类进行了鉴定，并对牙鲆进行免疫与攻毒，验证了热修饰性外膜蛋白30kDa的免疫保护力。具体方法结果如下：⑴用十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）抽提并结合超速离心的方法提取了一株大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的主要外膜蛋白。将外膜蛋白样品与等体积电泳上样缓冲液混合，分别经28℃、37℃、50℃、60℃、70℃、100℃处理5min后行SDS‐PAGE，发现样品经28℃处理，30kDa蛋白为外膜蛋白的主要高丰度蛋白，当样品经100℃处理，30kDa蛋白丰度显著降低，同时出现36kDa和37.5kDa两条明显的蛋白条带。28℃处理样品经电泳切胶洗脱得到30kDa纯化蛋白，分别经28℃、100℃处理后行SDS‐PAGE发现只有极少量蛋白呈现为30kDa，大部分呈现为36kDa和37.5kDa。将该蛋白样品作为抗原免疫大鼠制备抗血清，Western blotting分析上述梯度温度处理的SR1外膜蛋白。结果显示，抗血清与经各梯度温度处理的样品中的30kDa蛋白均发生免疫印迹反应，还与50℃处理样品中的37.5kDa蛋白及60℃、70℃、100℃处理样品中的36kDa和37.5kDa蛋白发生免疫印迹反应，表明了30kDa外膜蛋白具有经加热处理后转化为36kDa和37.5kDa蛋白的热修饰特性,是一种热修饰性蛋白。⑵对SR1等5株溶藻弧菌及副溶血弧菌、哈维氏弧菌等其他6种弧菌外膜蛋白分别经28℃、100℃处理5min后的SDS‐PAGE分析发现，溶藻弧菌各菌株的30kDa外膜蛋白和副溶血弧菌的29.5kDa外膜蛋白具有热修饰性。Westernblotting分析显示，抗血清可与28℃处理的溶藻弧菌各菌株的30kDa外膜蛋白和副溶血弧菌菌株的29.5kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应，还与100℃处理的溶藻弧菌各菌株的30kDa、36kDa（以及其中SR1的37.5kDa）和副溶血弧菌菌株的29.5kDa、35kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应，与其他5种弧菌的外膜蛋白不发生印迹反应。间接ELISA法检测结果显示鼠抗血清与溶藻弧菌SR1、283、284、RB、RH2及副溶血弧菌458的外膜蛋白反应均为阳性，与其他5种弧菌的外膜蛋白反应均为阴性。结果初步证实了溶藻弧菌SR1的30kDa外膜蛋白在溶藻弧菌种内具有较高的抗原保守性。⑶将溶藻弧菌283、284、RB、RH2的外膜蛋白分别经28℃、50℃、70℃、100℃温度处理5min后行SDS‐PAGE，发现4株菌株的外膜蛋白均呈现出了与SR1外膜蛋白相似的热迁移性，经28℃、50℃处理后有一条高丰度蛋白存在于30kDa分子量处，而经70℃、100℃处理此蛋白丰度降低为一条低丰度蛋白，同时在更高分子量位置有几条新蛋白条带出现。Western blotting结果显示鼠抗血清可与28℃处理的溶藻弧菌各菌株的30kDa外膜蛋白，还与100℃处理的各菌株的30kDa、36kDa外膜蛋白发生免疫印迹反应。胰蛋白酶消化试验结果显示各菌株的36kDa外膜蛋白被消化掉，消化产物分子量分别为19.5kDa、18kDa、18kDa、18.5kDa、19.5kDa。最后，为了对各菌株的热修饰性蛋白30kDa进行细胞表面定位，以各菌株的活菌菌体作为吸附剂对菌株SR1的热修饰性蛋白30kDa抗血清进行吸附试验，结果证实了各菌株的30kDa均暴露于细菌表面。该结果为接下来的免疫保护力分析试验提供了理论依据。⑷免疫保护力试验结果表明，免疫后第4周末以3株溶藻弧菌SR1、284、RH2对牙鲆攻毒感染后，免疫组呈现出显著高于未免疫组的成活率。以间接ELISA法测定了免疫后6周的抗血清效价变化，发现抗体效价缓慢升高并在第4周达到最高值，随后几周逐渐下降。⑸最后，以双向电泳技术对纯化的SR1的热修饰性蛋白的30kDa的蛋白质点组成进行分析，结果显示30kDa蛋白含有3个蛋白质点，等电点（pI）相同，均偏酸性（pH≈4.66），其中一质点保持于30kDa位置处，另外两个质点迁移至37.5kDa、36kDa处，经质谱鉴定均显示为OmpA。肽聚糖结合试验证实3个蛋白质点均不与肽聚糖结合或结合不紧密，胰蛋白酶消化结果显示，36kDa蛋白被消化成一分子量为19.5kDa的小分子多肽，而30kDa和37.5kDa蛋白可抵御消化，保持于原来的分子量处。热敏性研究结果显示随着处理温度的升高及时间的延长，30kDa和36k Da蛋白的丰度和位置始终保持不变，而37.5kDa蛋白在100℃温度下随着加热时间的延长蛋白丰度逐渐降低，同时有2条分子量分别为22kDa、15kDa的低分子量蛋白条带出现。以上结果表明溶藻弧菌SR1的热修饰性外膜蛋白30kDa是OmpA，且存在有3种特性不同的构象异构体。