禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位(主要是中和抗原表位)和T细胞表位(主要是CTL抗原表位),同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7(S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA)。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列,3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗(HRP标记兔抗鸡IgG)最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高(血清稀释度可达1∶300)、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利(专利授权号为200410081443.4)的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显著(P＜0.01),但组间差异不显著。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显著(P＜0.05)。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显著(P＜0.01),但组间差异不显著。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显著(P＜0.05)。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗(75%)。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗(75%);与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。